甲醛在有無苯作用下對細胞因子M-CSF、G-CSF和EPO轉錄的影響

袁朗月，問華肖，魏晨曦，楊　旭

(華中師范大學生命科學學院 遺傳調控與整合生物學湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430079)

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甲醛在有無苯作用下對細胞因子M-CSF、G-CSF和EPO轉錄的影響

袁朗月，問華肖，魏晨曦，楊旭

(華中師范大學生命科學學院 遺傳調控與整合生物學湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430079)

研究了甲醛在有無苯作用下對3種細胞因子巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)和促紅細胞生成素(EPO)轉錄水平的影響。將30只雄性BALA/c小鼠隨機分成5組，設為空白對照組、玉米油對照組、苯染毒組、甲醛染毒組、苯與甲醛聯合染毒組，每組6只，分別進行玉米油溶液、苯溶液灌胃染毒或甲醛氣態吸入染毒；染毒時間模擬工廠工作時間，每天8 h，連續兩周，第6 d、第7 d休息，第13 d染毒結束；取小鼠的骨髓和腎臟，提取其總RNA，并用實時熒光定量PCR技術對細胞因子M-CSF、G-CSF和EPO轉錄水平的變化進行檢測。結果表明，甲醛單獨作用可使M-CSF、G-CSF、EPO的轉錄水平下降；與苯聯合后，苯加強了甲醛對M-CSF轉錄水平的影響、削弱了甲醛對G-CSF和EPO轉錄水平的影響。

甲醛；苯；M-CSF；G-CSF；EPO；轉錄水平；實時熒光定量PCR

苯和甲醛是人造建筑材料和家居用品中的高危險性空氣污染物[1]。甲醛來源廣、毒性大。1987年，美國環境保護署(EPA)將甲醛歸為可能的人類致癌物(在濃度異常高或持續暴露的情況下)[2]；2006年，國際癌癥研究機構(IARC)將甲醛歸為人類致癌物A1組(可引起鼻咽癌，并可能引起白血病)；2009年9月，IARC將甲醛指定為人類已知的白血病誘因[3]；2011年，國家毒理學項目(NTP)的科學公告會議也將甲醛確定為人類已知的白血病誘因[4]。許多有關甲醛與白血病關系的證據均來自流行病學調查，但各種流行病學調查結果的不一致及偶然性使得白血病與甲醛暴露有關遭到質疑，因此需要進一步研究甲醛對白血病的影響機制[5-7]。

白血病的可能發病機制：直接損害骨髓干細胞。而干細胞若要發生癌變，就需要發生基因突變和基因組的不穩定[8]。骨髓位于大骨骼的腔體中，含有造血干細胞以及多種其它干細胞。造血是干細胞增殖、分化及成熟為血細胞的動態平衡過程。諸多因素均可調控此過程，最為重要的是細胞因子(一種可以傳遞細胞增殖分化信號的分泌蛋白)的調控，不僅可以刺激成熟血細胞行使功能，還可調節造血干細胞的增殖、分化及成熟[9]。作者在此選取3種細胞因子M-CSF、G-CSF和EPO作為研究對象，研究甲醛在有無苯作用下對其轉錄水平的影響。

1　實驗

1.1實驗動物

BALA/c小鼠，雄性，體重22 g左右，購于武漢大學動物實驗中心。

1.2試劑與儀器

甲醛溶液(質量分數10%)，Sigma公司；苯(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；RNAiso Plus(總RNA提取試劑)、Oligo(dT)12-18 Primer、Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)、dNTP Mixture、RNase Inhibitor、SYBR?Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)，寶生物工程(大連)有限公司。

WH-2型智能環境氣候艙，武漢宇信科技開發公司；4160-2型氣態甲醛濃度測定儀，美國Interscan公司；5415R型低溫冷凍離心機，德國Eppendorf公司；ND-1000、CFX96型熒光定量PCR儀，美國BIO-RAD公司。

1.3方法

1.3.1實驗動物分組

將30只小鼠隨機分成5組：空白對照組、玉米油對照組、苯染毒組、甲醛染毒組、苯與甲醛聯合染毒組，每組6只。每天分別對5組小鼠進行稱重，然后采用仿真式暴露染毒。

具體染毒過程：

1)空白對照組：每天在輸入新鮮空氣的玻璃缸內待8 h。

2)玉米油對照組：每天上午，在相同的時間以濃度為150 mg·kg-1的玉米油進行灌胃染毒。

3)苯染毒組：每天上午，在相同的時間以濃度為150 mg·kg-1的苯溶液進行灌胃染毒。

4)甲醛染毒組：每天連續動態染毒8 h(在玻璃染毒缸中進行)，經智能環境氣候艙調配后，甲醛以濃度為3.0 mg·m-3(我國2000年前相關職業衛生標準規定的工作場所最高允許濃度)的氣體持續穩定地輸出。艙參數為：氣體濕度45%，氣溫(23±0.5) ℃，過艙氣體流量1 L·min-1。

5)苯與甲醛聯合染毒組：按3)、4)方法進行苯與甲醛聯合染毒。

染毒期間，所有小鼠禁止進食和飲水。

1.3.2總RNA的提取

1)骨髓和腎臟的處理：染毒結束(第13 d)后將小鼠脫頸處死，取出股骨，用注射器吸取1 mL RNAiso Plus，將骨髓沖入EP管中(反復多次，直至股骨變白)，顛倒混勻10下，22 ℃靜置15 min，待溶液透明后馬上置于冰上，然后可于-70 ℃長期保存。染毒結束(第13 d)后將小鼠脫頸處死，取出腎臟，加液氮研成粉末，加1 mL RNAiso Plus覆蓋，液氮溶解后將液體吸入EP管中，顛倒混勻10下，22 ℃靜置15 min，待溶液透明后馬上置于冰上，然后可于-70 ℃長期保存。

2)提取總RNA：在上述裝有骨髓和腎臟的EP管中加入1/5體積的氯仿，顛倒混勻10下，劇烈振蕩15 s，22 ℃靜置5 min后于4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min；將上層水相轉入另一EP管中，重復上述操作；加等體積異丙醇，混勻，在低溫冰上放置10 min，于4 ℃、12 000×g離心10 min；小心棄上清，加預冷的80%乙醇(用DEPC水配制)1 mL，輕顛倒，于4 ℃、1 000 r·min-1離心5 min；棄上清，EP管口向下在濾紙上盡量吸干管口乙醇；平放EP管，空氣干燥5～10 min，溶于20 μL DEPC水中，用紫外分光光度計測定總RNA的濃度和純度，重復測定3次。OD260和OD280之間的比值應該在1.9～2.0之間。

1.3.3引物設計

由Primer 5.0軟件設計并用NCBI的Primer-Blast檢測。引物序列如下：

M-CSF：上游TTCCATCCTCACCCTTAGAC，下游TTCTGCTCCTTCTCATCTGTCCTGG；EPO：上游GAATGGAGGTGGAAGAACAGG，下游ACCCGAAGCAGTGAAGTGAG；G-CSF：上游GGGA-AGGAGATGGGTAAAT，下游GCTGCCACTGTT-TCTTTAGGGACTT；β-actin：上游GCATTGTTACCAACTGGGACG，下游TGGCTGGGGTGTTGAAGG。

1.3.4將RNA反轉錄成cDNA

配制20 μL反轉錄體系：取Oligo(dT) 2 μL、總RNA 1 μg，加DEPC水至12 μL，點離，70 ℃變性10 min，立即冰浴5 min，繼續加入5×M-MLV Buffer 4 μL、dNTP Mixture 1 μL、RRI 0.5 μL、 M-MLV 0.5 μL，加DEPC水至20 μL，42 ℃保溫1 h，75 ℃保溫15 min，然后于4 ℃保存。

1.3.5實時熒光定量PCR

采用DNA熒光染料SYBR Green I對M-CSF、G-CSF和EPO進行實時熒光定量PCR。反應體系：上下游引物0.4 μL，模板1 μL，SYBR?Premix Ex TaqTM10 μL，RNase Free水8.24 μL。模板分別設有內參組和樣品組，每個樣品設3個重復。通過預實驗，摸索出3種細胞因子的實時熒光定量PCR退火溫度T。實時熒光定量PCR反應程序如下：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，T溫度退火30 s，72 ℃延伸30 s，熒光檢測，共39個循環。繪制3種細胞因子的融解曲線。實驗結果用2-△△Ct表示，即3種細胞因子在實驗組的表達量是對照組的2-△△Ct倍，△△Ct是指實驗組與對照組的△Ct之差，△Ct=Ct樣品組-Ct內參組(Ct值為每個反應管內開始指數擴增時對應的循環數)。

1.4統計學分析

用2-△△Ct進行定量分析，用Origin軟件進行統計學分析。采用T檢驗和單因素方差分析檢驗不同組間數據的差異顯著性，P<0.05為顯著性差異，P<0.01為極顯著性差異。

2　結果與討論

2.1M-CSF的轉錄水平變化

經過處理后，骨髓細胞中的M-CSF的轉錄水平變化如圖1所示。

由圖1可知：(1)相對空白對照組：苯染毒組M-CSF的轉錄水平有下降趨勢，但無顯著性(P>0.05)；甲醛染毒組M-CSF的轉錄水平極顯著下降(P<0.01)；聯合染毒組M-CSF的轉錄水平極顯著下降(P<0.01)。(2)相對聯合染毒組：苯染毒組M-CSF的轉錄水平極顯著上升(P<0.01)；甲醛染毒組M-CSF的轉錄水平有上升趨勢，但無顯著性(P>0.05)。表明，甲醛單獨作用可使M-CSF的轉錄水平下降，與苯聯合后，苯加強了甲醛對M-CSF轉錄水平的影響。

A.空白對照組　B.玉米油對照組　C.苯染毒組　D.甲醛染毒組　E.苯與甲醛聯合染毒組　**：與空白組對照，P<0.01　##：與聯合組對照，P<0.01

2.2G-CSF的轉錄水平變化

經過處理后，骨髓細胞中的G-CSF的轉錄水平變化如圖 2所示。

A.空白對照組　B.玉米油對照組　C.苯染毒組　D.甲醛染毒組　E.苯與甲醛聯合染毒組　**：與空白組對照，P<0.01　##：與聯合組對照，P<0.01

由圖 2 可知：(1) 相對空白對照組：苯染毒組G-CSF的轉錄水平極顯著上升(P<0.01)；甲醛染毒組G-CSF的轉錄水平極顯著下降(P<0.01) ；聯合染毒組G-CSF的轉錄水平極顯著上升。(2)相對聯合染毒組：苯染毒組G-CSF的轉錄水平有上升趨勢，但無顯著性(P>0.05)；甲醛染毒組G-CSF的轉錄水平極顯著下降(P<0.01)。表明，甲醛單獨作用可使G-CSF的轉錄水平下降，與苯聯合后，苯削弱了甲醛對G-CSF轉錄水平的影響。

2.3EPO的轉錄水平變化

經過處理后，腎臟中EPO的轉錄水平變化如圖3所示。

A.空白對照組　B.玉米油對照組　C.苯染毒組　D.甲醛染毒組　E.苯與甲醛聯合染毒組　**：與空白組對照，P<0.01　##：與聯合組對照，P<0.01

由圖 3 可知：(1) 相對空白對照組：苯染毒組EPO的轉錄水平極顯著上升(P<0.01)；甲醛染毒組EPO的轉錄水平極顯著下降(P<0.01) ；聯合染毒組EPO的轉錄水平極顯著上升。(2)相對聯合染毒組：苯染毒組EPO的轉錄水平有下降趨勢，但無顯著性(P>0.05)；甲醛染毒組EPO的轉錄水平極顯著下降(P<0.01)。表明，甲醛單獨作用可使EPO的轉錄水平下降，與苯聯合后，苯削弱了甲醛對EPO轉錄水平的影響。

2.4討論

流行病學和實驗數據均顯示甲醛可導致白血病，尤其是骨髓性的白血病，然而其致病機理卻不清楚[6]。氧化應激被認為是甲醛可能引發損傷的一種機制[10]，多項研究表明，ROS(尤其是H2O2)的產生在甲醛引起的毒性中扮演重要角色[11-12]。H2O2可打開MPTP(線粒體通透性轉換孔)，降低基因轉錄、翻譯的活度，從而減少細胞凋亡[13-14]。由此可以解釋甲醛單獨作用時M-CSF、G-CSF和EPO的轉錄水平下降。

Wei等[15]通過miRNA的表達譜法研究苯暴露對小鼠造血作用的影響，將C57BL/6小鼠暴露于濃度為150 mg·kg-1的苯中，結果發現，苯暴露可使小鼠的白細胞、紅細胞、淋巴細胞的數量減少。本研究中，苯的暴露濃度為150 mg·kg-1，因而小鼠的白細胞、紅細胞、粒細胞、淋巴細胞的數量較空白對照組應降低。

G-CSF能刺激骨髓粒細胞前體，使之分化增殖為成熟粒細胞的集落[16-17]。EPO主要通過促進骨髓中紅系祖細胞的存活、增殖和分化以調控紅細胞的生成[18]。本研究中，在苯作用下，G-CSF和EPO的轉錄水平上升可能是機體反饋調節的作用所致。

Andrews等[19]研究表明，甲醛作為苯的代謝競爭抑制劑，可以降低苯的代謝和毒性。本研究中，甲醛與苯聯合作用后，苯削弱了甲醛對G-CSF和EPO轉錄水平的影響，可能是因為甲醛是苯的代謝競爭抑制劑。然而對于M-CSF的轉錄水平變化，甲醛與苯聯合作用后，苯卻加強了甲醛對M-CSF的轉錄水平的影響。這可能是因為，苯具有高揮發性，實驗操作時因揮發使其濃度降低，Wetmore等[20]研究表明，在低濃度時，苯可以加強甲醛對小鼠的代謝和基因毒性，這也是本研究中苯可以加強甲醛對M-CSF轉錄水平的影響的原因。

3　結論

研究了甲醛在有無苯作用下對巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)和促紅細胞生成素(EPO)等3種細胞因子轉錄水平的影響。結果表明，甲醛單獨作用可使M-CSF的轉錄水平下降；與苯聯合后，苯加強了甲醛對M-CSF轉錄水平的影響、削弱了甲醛對G-CSF和EPO的轉錄水平的影響。

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Effect of Formaldehyde on Transcription of Cytokine M-CSF,G-CSF and EPO in the Presence and Absence of Benzene

YUAN Lang-yue,WEN Hua-xiao,WEI Chen-xi,YANG Xu

(HubeiKeyLaboratoryofGeneticRegulationandIntegrativeBiology,CollegeofLifeSciences,CentralChinaNormalUniversity,Wuhan430079,China)

Effectsofformaldehydeonthetranscriptionlevelofmacrophagecolonystimulatingfactor(M-CSF),granulocytecolonystimulatingfactor(G-CSF)anderythropoietin(EPO)inthepresenceandabsenceofbenzenewereinvestigated.ThirtyBALA/cmalemicewererandomlydividedinto5groups(6foreachgroup):blankcontrolgroup,cornoilcontrolgroup,benzeneexposuregroup,formaldehydeexposuregroup,benzeneassociatedwithformaldehydeexposuregroup.Andthemicewereexposedbyintragastricadministrationofcornoilsolutionorbenzenesolution,formaldehydegassuction,respectively.Exposuretimewassimulatedfactoryworkschedule,8hadayfortwoweeks,withanexposure-free“weekend”ondays6and7,sacrificedonday13.ThebonemarrowandkidneywerepreparedtoextracttotalRNA,thenreal-timefluorescencequantitativePCRtechniquewasappliedtotestthechangeoftranscriptionlevelforcytokineM-CSF,G-CSFandEPO.Resultsshowedthat,formaldehydealonecoulddecreasethetranscriptionlevelofM-CSF,G-CSFandEPO,whenformaldehydeassociatedwithbenzene,benzenecouldenhancetheinfluenceofformaldehydeontranscriptionlevelofM-CSF,weakentheinfluenceofformaldehydeontranscriptionlevelofG-CSFandEPO.

formaldehyde;benzene;M-CSF;G-CSF;EPO;transcriptionlevel;real-timefluorescencequantitativePCR

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.08.007

國家自然科學基金資助項目(51136002)

2016-03-27

袁朗月(1989-)，女，湖北武漢人，碩士研究生，研究方向：分子毒理學，E-mail：1048896082@qq.com；通訊作者：楊旭，教授，E-mail：yangxu@mail.ccnu.edu.cn。

R 994.6R 318

A

1672-5425(2016)08-0031-04

袁朗月，問華肖，魏晨曦，等.甲醛在有無苯作用下對細胞因子M-CSF、G-CSF和EPO轉錄的影響[J].化學與生物工程，2016，33(8)：31-34，38.