基于顯微操作的高效細胞電融合芯片的設(shè)計

舒承松，陳瑞華，汝長海,2

(1.蘇州大學(xué) 江蘇省先進機器人技術(shù)重點實驗室，江蘇 蘇州 215123；2.蘇州大學(xué) 蘇州納米科技協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 蘇州 215123；3.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床免疫研究所，江蘇 蘇州 215006)

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基于顯微操作的高效細胞電融合芯片的設(shè)計

舒承松1，陳瑞華3，汝長海1,2

(1.蘇州大學(xué) 江蘇省先進機器人技術(shù)重點實驗室，江蘇 蘇州 215123；2.蘇州大學(xué) 蘇州納米科技協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 蘇州 215123；3.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床免疫研究所，江蘇 蘇州 215006)

設(shè)計了一款基于顯微操作的高效細胞電融合芯片，并針對該電融合芯片提出了一種快速、準(zhǔn)確、靈活的細胞配對融合操作方法。芯片使用ITO玻璃作為基底，在ITO上覆蓋一層2 μm厚的正光刻膠，并利用光刻加工技術(shù)在光刻膠上加工出直徑25 μm的微孔電極。設(shè)計了不同電極間距的微孔電極陣列，與鎢針電極構(gòu)成電融合電極對進行了細胞電融合實驗。結(jié)果表明，電極間距為10 mm的微孔電極陣列能夠?qū)崿F(xiàn)高效的細胞配對，在間距為0.5 mm的微孔電極陣列上未觀測到細胞吸附現(xiàn)象。

顯微操作；配對方法；電融合芯片；光刻；微孔電極

細胞電融合是一種發(fā)展迅速的細胞工程技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于植物雜交[1]、抗腫瘤疫苗制備[2]和單克隆抗體制備[3]等領(lǐng)域?？焖贉?zhǔn)確地實現(xiàn)待融合細胞的配對一直是細胞電融合的研究熱點。國內(nèi)外研究機構(gòu)對目標(biāo)細胞配對進行了大量研究，并利用現(xiàn)代微加工技術(shù)設(shè)計了很多高效的電融合芯片。

麻省理工研究團隊設(shè)計了雙面凹形的微陷阱陣列，通過控制融合芯片內(nèi)部的液體流動，使體積相近的兩種細胞準(zhǔn)確快速地配對[4]，后續(xù)通過改進陷阱的結(jié)構(gòu)使體積相差較大的細胞也能排隊融合[5-6]。重慶大學(xué)研究團隊一直致力于高通量微電極陣列芯片的研究，通過優(yōu)化電極的形狀與位置，不斷提高細胞電融合芯片的精度與效率[7-9]。這些芯片主要針對單克隆抗體或腫瘤疫苗制備等需進行大量細胞配對的場合；若細胞數(shù)量較少，易造成細胞丟失而導(dǎo)致細胞配對率低。如牛的體細胞核移植時，需將供體細胞與去核卵母細胞電融合。由于兩種細胞體積相差較大，使用目前的電融合芯片難以準(zhǔn)確配對。目前常選擇人工操作微電極移動細胞進行配對，操作復(fù)雜，實驗穩(wěn)定性較差。

Clow等[10]針對這種情況，利用光刻膠覆蓋一對交錯的鈦電極，設(shè)計了一款獨特的微孔電極陣列芯片，將以前需人工操作的微電極固定，通過移液管將細胞搬運到電極附近，再使用介電泳力將細胞配對。這款芯片的優(yōu)點是操作簡單、易實現(xiàn)自動化，缺點是針對不同體積的細胞需要設(shè)計不同間距的電極，不夠靈活。

相比于一對固定電極或者一對移動電極，一側(cè)固定電極、一側(cè)移動電極的設(shè)計能夠很好地綜合兩者的優(yōu)點，并且在最大程度上避免兩者的缺點。作者將自制的微孔電極陣列芯片與一根尖端約20μm的鎢針電極構(gòu)成一對融合電極，進行了細胞電融合實驗，并探討了不同間距的微孔電極陣列對實驗結(jié)果的影響。

1　細胞電融合原理

細胞電融合過程分為3步：第一步，細胞配對，使用物理或者化學(xué)方法使待融合細胞緊密接觸，并沿電場線方向排列；第二步，細胞膜可逆性電穿孔，對待融合細胞施加高壓電脈沖，使得細胞接觸部分的細胞膜產(chǎn)生可逆性穿孔；第三步，細胞膜融合，繼續(xù)保持細胞間的緊密接觸直到細胞完成膜融合。細胞電融合過程如圖1所示。

細胞配對細胞膜可逆性電穿孔細胞膜融合

圖1細胞電融合過程示意圖

Fig.1Schematic images of cell electrofusion process

由圖1可知，在加入正弦交變電場后，電場中的細胞被極化形成電偶極子，并在介電泳力的作用下在電極上排隊(圖1a)；細胞膜在高壓電脈沖下出現(xiàn)可逆性電穿孔，電解液中溶質(zhì)進入細胞使得細胞膜膨脹(圖1b)；繼續(xù)保持正弦信號使得細胞依然緊密接觸直至細胞完成膜融合(圖1c)。

2　芯片的設(shè)計與制造方法

實驗所用雜交瘤細胞直徑在18～25 μm之間，因此將微孔電極直徑設(shè)計為25 μm。

在最初的電極設(shè)計中，微孔電極陣列的電極間距為0.5 mm，實驗時使用1滴融合液將電極全部覆蓋，但在實驗過程中未觀察到微孔電極吸附細胞的現(xiàn)象，初步推測可能是多個電極在融合液滴中產(chǎn)生的電場相互干擾，減小了細胞受到的介電泳力。

因此，將電極間距改為10 mm，實驗中每個微孔電極用1個微滴單獨覆蓋，并以0.5 mm間距的電極陣列作為對照。

圖2為設(shè)計的掩模板(40 mm×40 mm)。

a.0.5 mm間距的電極陣列　b.10 mm間距的電極陣列　c.用于接出導(dǎo)線，連接融合信號發(fā)生器　d.無電極，在實驗時放置待操作的細胞

在鍍有氧化銦錫(ITO)薄膜(厚度約180 nm)的玻璃上旋涂一層厚度約為2 μm的正光刻膠RZJ-390PG。在100 ℃前烘90 s后蓋上掩模板曝光5 s；120 ℃后烘120 s后，放入顯影液中60 s。顯影完畢后用去離子水清洗芯片，在顯微鏡下觀察芯片是否加工完成。加工完成的電極芯片如圖3所示。

電極芯片實物圖0.5 mm間距的電極陣列

圖3電極芯片

Fig.3Electrode chip

3　實驗

3.1材料與儀器

雜交瘤細胞 pd1-612由蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院提供；電融合緩沖液(溶液成分0.3 mol·L-1甘露醇，0.1 mmol MgCl2，0.1 mmol CaCl2，37 ℃時電導(dǎo)率為80 μS·cm-1)。

TE2000型倒置顯微鏡，Nikon公司；定位運動平臺，Prior公司；MP285型顯微操作儀，Sutter公司；A601f型CCD攝像機，Basler公司； PHD ULTRATM4400型微量注射泵，Harvard公司；恒溫?zé)崤_，TOKAT HIT公司；自制電融合儀。

3.2實驗準(zhǔn)備

將自制30 μm內(nèi)徑的玻璃移液管與微量注射泵連接，安裝在左操作手上，對細胞進行吸吐與搬運操作。將鎢絲尖端磨至20 μm，裝在右操作手上并與自制電融合儀相連。自制的電融合芯片放置在定位運動平臺上，并與自制電融合儀連接。細胞電融合顯微操作系統(tǒng)如圖4所示。

在細胞配對與電融合實驗中，由于細胞培養(yǎng)液中離子濃度很高，在外加電場下會產(chǎn)生明顯的焦耳熱現(xiàn)象，使液體產(chǎn)生對流影響細胞排隊，同時較高的離子濃度也會降低溶液中的電場梯度，影響細胞電穿孔效果。因此實驗開始前需將細胞離心，且用37 ℃的電融合緩沖液替換細胞培養(yǎng)液。

3.3細胞配對實驗

(1)控制平臺移動，在顯微鏡下找到電融合芯片上微孔電極的位置并記錄。

圖4　細胞電融合顯微操作系統(tǒng)

(2)用移液槍在微孔電極上方滴加不含細胞的電融合液。用100 μL溶液覆蓋0.5 mm間距電極陣列的整個區(qū)域；用4滴50 μL的溶液分別覆蓋10 mm間距電極陣列中的4個微孔電極。

(3)用移液槍吸取適量含有細胞的電融合液加入到芯片上無電極區(qū)域。使用左操作手與微量注射泵控制玻璃移液管吸取少量細胞。

(4)將平臺移動到微孔電極所在區(qū)域，控制右操作手帶動鎢針電極靠近微孔電極，并打開自制電融合儀，接通細胞配對信號(-2～2 V，1 MHz，正弦波)。

(5)控制左側(cè)玻璃移液管在微孔電極附近吐出一個細胞。細胞將在重力與介電泳力的作用下吸附在底部微孔電極上。

(6)控制左側(cè)玻璃移液管吐出第二個細胞，這次細胞吐出的位置應(yīng)稍稍偏右，有助于細胞與上一個細胞形成細胞串。

(7)待細胞成串排列后，加入細胞電穿孔信號，完成電穿孔后，保持細胞配對信號30 s，等待細胞膜融合。

(8)待細胞完成膜融合后，移動平臺到另一個微孔電極處，重復(fù)步驟(4)～(7)。

4　結(jié)果與討論

圖5為電極間距為0.5 mm的電極陣列中細胞的運動過程。

圖5a中，細胞位于微孔電極附近，但此時細胞并未在介電泳力的作用下向微孔電極移動。圖5b中，控制右側(cè)鎢針電極靠近微孔電極后，細胞在介電泳力的作用下吸附到鎢針電極上。

圖6為電極間距為10 mm的電極陣列中細胞的配對過程。

圖6a中，移液管吐出的細胞在介電泳力與重力的作用下被微孔電極吸附。圖6b中，移液管吐出的兩個細胞成串排列。

細胞位于微孔電極附近　　　　　細胞吸附到鎢針電極上

單個細胞吸附兩個細胞成串配對

圖6細胞配對過程

Fig.6Cell paring process

結(jié)果表明，采用0.5 mm間距的電極陣列進行細胞配對實驗時，由于一個微滴中有多個電極的存在，導(dǎo)致細胞受到的介電泳力減弱，細胞由于細胞膜粘附力的作用，附著在芯片上，沒有發(fā)生移動。增大排隊信號幅值或減小電極間距后，細胞向右側(cè)鎢針電極移動。

當(dāng)電極間距為10 mm時，一滴50 μL的微滴僅覆蓋了一個微孔電極，微滴中的電場分布情況簡單，可以簡化成兩根針尖電極對細胞進行作用。在外加峰峰值為2 V、頻率為1 MHz的正弦排隊信號后，微孔邊緣周邊50 μm內(nèi)的腫瘤細胞能以20 μm·s-1的速度向電極中心移動。

5　結(jié)論

所有的細胞核移植過程中都需要使待融合的細胞緊密接觸，并且盡量使細胞對的長軸與電場線方向平行。由操作員手動調(diào)整待融合細胞的位置的方法難度較大，并且容易給實驗帶來干擾。

針對這種需要對少量細胞進行快速準(zhǔn)確配對的細胞融合實驗，設(shè)計了一種新的細胞電融合芯片，基于該芯片提出了一種細胞電融合顯微操作方法。細胞配對實驗結(jié)果表明，10 mm間距的微孔電極陣列能夠高效地實現(xiàn)細胞排隊。

該芯片制作簡單、操作容易、適用于多種直徑的細胞。與同領(lǐng)域的其它細胞電融合顯微操作方法相比，本方法對人工操作精度的要求更低，更容易實現(xiàn)細胞配對的自動化。

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Design of an Efficient Cell Electrofusion Chip Based on Micromanipulation

SHU Cheng-song1,CHEN Rui-hua3,RU Chang-hai1,2

(1.JiangsuProvincialKeyLaboratoryofAdvancedRobotics,SoochowUniversity,Suzhou215123,China;2.CollaborativeInnovationCenterofSuzhouNanoScienceandTechnology,SoochowUniversity,Suzhou215123,China;3.InstituteofClinicalImmunology,TheFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou215006,China)

Anefficientcellelectrofusionchipbasedonmicromanipulationwasdesigned.Afast,accurateandflexiblecellpairingmethodwasdevelopedforthiselectrofusionchip.Thechipprototypewasfabricatedonanindiumtinoxide(ITO)substratethatwassubsequentlycoveredbyapositivephotoresistfilmwiththethicknessof2μm.Microporeelectrodesmeasuring25μmindiameterwerefabricatedonthefilmbylithography.Microporeelectrodearrayswithdifferentspacingsweremanufacturedandpairedwithtungstenneedleforcellelectrofusionexperiment.Resultsshowedthatmicroporeelectrodearraywitha10mmspacingcouldpairthecellefficiently,howevercellsalignonthemicroporeelectrodearraywith0.5mmspacingwasnotobserved.

micromanipulation;pairingmethod;electrofusionchip;lithography;microporeelectrode

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.08.015

國家重大科研儀器設(shè)備研制專項(61327811)，國家自然科學(xué)基金資助項目(61174087，61233010)，江蘇省杰出青年基金資助項目(BK2012005)

2016-03-31

舒承松(1990-)，男，湖北武漢人，碩士研究生，研究方向：顯微操作系統(tǒng)，E-mail：sudamugong@163.com；通訊作者：汝長海，教授，E-mail：rzh@suda.edu.cn。

Q 813.2

A

1672-5425(2016)08-0063-04

舒承松，陳瑞華，汝長海.基于顯微操作的高效細胞電融合芯片的設(shè)計[J].化學(xué)與生物工程，2016，33(8)：63-66.