晚期乳腺癌患者自體自然殺傷細胞的體外培養及其殺傷活性分析

高萬軍，黃啟明，祁楠（北大醫療魯中醫院，山東淄博55400；怡諾博（北京）生物醫學技術有限公司；解放軍總醫院第一附屬醫院）

晚期乳腺癌患者自體自然殺傷細胞的體外培養及其殺傷活性分析

高萬軍1，黃啟明2，祁楠3
（1北大醫療魯中醫院，山東淄博255400；2怡諾博（北京）生物醫學技術有限公司；3解放軍總醫院第一附屬醫院）

目的 分析晚期乳腺癌自體自然殺傷（NK）細胞體外培養能否激活與免疫監視密切相關的NK細胞，并產生抗腫瘤免疫作用。方法 取10例晚期乳腺癌患者和10例正常女性外周血，單個核細胞誘導擴增得到活化NK細胞，分別檢測NK細胞增殖和表型，NK細胞對乳腺癌細胞的細胞毒性及乳腺癌鼠模型體內抗腫瘤活性。結果 兩者來源NK細胞增殖差異無統計學意義，培養到第15天NK細胞數均達到1.0×109以上，均高表達80%以上的CD3-CD16+CD56+表型，兩者間差異無統計學意義；體外實驗兩者對乳腺癌細胞均有較好的細胞毒性，晚期乳腺癌患者和正常女性來源NK細胞殺傷乳腺癌細胞之間無統計學差異（P＞0.05）。結論 晚期乳腺癌患者自體NK細胞經體外活化后具有與正常女性同樣的誘導增殖效果，對乳腺癌有較好的細胞殺傷活性。

乳腺腫瘤；自然殺傷細胞；細胞表型；細胞毒性；免疫細胞治療

乳腺癌是女性惡性腫瘤中最常見的一種，晚期患者5年內具有高度的侵襲性和轉移性［1，2］。大多數研究主要分析由T細胞介導的特異性抗腫瘤免疫作用，對自然殺傷（NK）細胞的免疫功能研究相對較少，因乳腺癌具有特殊的免疫學特性，在其發生、發展過程中由NK細胞發揮主要的免疫監視作用［3］。乳腺癌細胞體內通過抑制受體調控NK細胞免疫作用，使得NK細胞殺傷活性受到抑制，激活NK細胞活化受體，對靶細胞產生細胞殺傷活性［4］，而獲取足夠數量且活化的NK細胞是治療乳腺癌的核心，亦是目前乳腺癌免疫治療臨床與基礎研究的難點。自然殺傷細胞抑制性受體（KIR）及活化受體（KAR）的發現對NK細胞在識別和裂解腫瘤細胞中起關鍵作用［5］，但腫瘤患者自體來源NK細胞的免疫功能尚不明確，其能否被激活，并增強機體抗腫瘤的免疫作用研究較少。本研究擬采用晚期乳腺癌患者和正常人來源的自體NK細胞，體外激活NK細胞活性并進行體內體外殺傷乳腺癌試驗，觀察不同來源NK細胞增殖作用及體內抗乳腺癌活性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2014年11月～2015年6月在北大醫療魯中醫院住院的10例晚期乳腺癌患者，年齡27～56（41.6±2.4）歲。根據WHO及2009年國際抗癌聯盟確立的乳腺癌分類標準ⅢB期7例、Ⅳ期3例，淋巴結轉移6例、無轉移4例。入選患者接受過手術和（或）化療1個月以上，患者血常規白細胞均＞2×109/L，單核細胞＞0.1×109/L，淋巴細胞＞0.8×109/L，卡氏評分在60分以上；排除有嚴重器官衰竭、自身免疫性疾病和處于孕期的患者。另選擇同期體檢健康的正常女性10例作為對照，年齡31～55歲。

1.2 自體NK細胞的分離與培養 采集晚期乳腺癌患者和正常女性者抗凝外周血30 mL，加入等量1 ×PBS稀釋，沿離心管管壁輕輕疊加于淋巴細胞分離液上，室溫下2 000 r/min離心20 min，吸取界面層的PBMC，洗滌2次。1×PBS調整單個核細胞濃度為1×107/mL。用9份Percoll原液加1份8.5%氯化鈉溶液配置成100%Percoll工作液，將Percoll工作液配成37.5%～50%6個密度梯度，每個梯度相差2.5%，按密度由高至低緩緩加于15 mL離心管中，將細胞輕輕疊加于上層，2 000 r/min離心30 min，吸取42.5%～45%梯度的細胞，計數。將NK細胞按照濃度為（1～5）×106/mL培養于含IL-15 100 ng/mL、IL-18 50 ng/mL、IL-2 50 U/mL和OKT3 50 ng的AIM-V完全培養基中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，用含IL-2 50 U/mL的AIM-V完全培養基連續擴增培養到第21天。使用活細胞計數儀分別在第0、6、9、12、15、18和21天進行計數，分析NK細胞活率和增殖倍數。

1.3 NK細胞表型檢測 取晚期乳腺癌患者和正常女性者來源第14天培養獲得的1×106NK細胞，進行流式抗體染色檢測分析。NK細胞一組分別為鼠抗人CD16-FITC 20 μL、鼠抗人CD56-PE 20 μL和鼠抗人CD8-PerCP 20 μL；另一組分別為鼠抗人CD3-FITC 20 μL、鼠抗人CD25-PE 20 μL和鼠抗人CD4-PerCP 20 μL；同型對照組為mIgG1-FITC 20 μL、mIgG1-PE 20 μL和mIgG1-PerCP 20 μL；置4℃冰箱染色30 min后用PBS洗滌3次，然后在FACSCalibur儀器（美國BD公司）上檢測并分析。

1.4 乳腺癌細胞系培養 從液氮罐中取出凍存MDA-MB-231和MCF-7細胞，快速置于37℃水浴中，完全溶解后緩慢移入已加入10 mL 1×PBS的離心管中，混勻，1 200 r/min，離心10 min，棄上清，用RPMI1640培養基1 mL重懸細胞，混勻，加入75 cm2培養瓶，再加入RPMI1640培養液（含10%胎牛血清）10 mL。培養24 h后，觀察MDA-MB-231和MCF-7細胞己經貼壁，更換新鮮的培養液繼續培養。細胞生長至90%以上鋪滿時，吸除培養瓶中的液體。加入0. 25%胰蛋白酶1 mL，加入含10%FBS的RPMI1640培養基2 mL，移入離心管中離心10 min。加入含10% FBS的RPMI1640培養基5 mL，按1∶2比例分瓶傳代后，繼續于37℃，5%CO2培養箱中孵育細胞。取穩定傳代的第3～5代細胞進行實驗。取處于對數生長期的細胞用于實驗，收集細胞，懸浮細胞稀釋后，經苔盼蘭染色后，在光學顯微鏡下觀察計數。

1.5 NK細胞體外抗乳腺癌的細胞毒性測定 采用乳酸脫氫酶（LDH）法。分別以MDA-MB-231和MCF-7細胞為靶細胞，刺激NK細胞作為效應細胞，按效靶比40∶1、20∶1、10∶1、5∶1和2.5∶1分別加入96孔培養板中，之后置于37℃、5%CO2條件下培養4 h，均設3個復孔。采用LDH細胞毒實驗法測定NK活性：吸取上清液50 μL，置于96孔板中，加入LDH基液50 μL，室溫避光30 min，加入50 μL終止液終止反應，490 nm波長處測吸光度（OD）值，計算MDA-MB-231和MCF-7細胞的殺傷率。

1.6 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。計量資料以±s表示，采用配對t檢驗分析NK細胞表型及其引發NK細胞增殖能力與表型；NK細胞對乳腺癌細胞株的抑瘤比較采用成組比較t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同來源NK細胞體外培養增殖分析 來源于乳腺癌和正常女性者培養的NK細胞CD16、CD56純度無統計學差異（P=0.53）。隨著體外培養天數增加，NK細胞數不斷提高，到第15、18和21天時乳腺癌患者NK細胞數均值分別為0.89×109、1.28× 109和2.04×109個，擴增倍數均值分別為477.73倍、686.16倍和1 094.75倍；正常女性NK細胞數均值分別為1.05×109、1.32×109和2.46×109個，擴增倍數均值分別為651.36倍、817.54倍和1 529.59倍；兩者在NK細胞計數和增殖倍數上均無統計學差異（P均＞0.05）。

2.2 不同來源NK細胞表型表達對比 乳腺癌患者和正常女性表達CD分子陽性率平均值見表1，兩者均有NK特征表型CD16CD56陽性，CD3、CD4和CD8表型表達均很低，CD4+CD25+的調節性T淋巴細胞很少。體外培養獲得NK細胞主要為CD16+CD56+細胞，含CD3+T淋巴細胞很低，晚期乳腺癌患者與正常女性對比均無統計學差異。

表1 不同人群自體NK細胞表型陽性率比較（%±s）

研究對象細胞表型CD16+CD56+CD3+CD3+/CD8+CD3+/CD4+CD4+/CD25+乳腺癌患者87.19±6.783.50±1.223.23±1.163.32±1.342.13±0.67正常女性84.25±5.494.66±1.233.48±0.574.21±1.452.67±1.10

2.3 不同來源NK細胞引發的抗腫瘤細胞毒性細胞毒性實驗中對靶細胞乳腺癌細胞株MCF-7和MDA-MB-231的效靶比從2.5∶1到40∶1，隨著效靶比逐漸增加，NK細胞對腫瘤細胞殺傷活性逐漸增加（圖1）。晚期乳腺癌患者和正常女性來源NK細胞對MCF-7和MDA-MB-231在效靶比為40∶1時達到的平均抑瘤率達到最高，但晚期乳腺癌患者和正常女性來源NK細胞殺傷乳腺癌細胞之間無統計學差異，P分別為0.49和0.52，晚期乳腺癌患者自體的NK細胞對腫瘤殺傷具有同樣活性。

圖1 晚期乳腺癌患者和正常女性自體NK細胞對MDA-MB-231的殺傷活性

3 討論

目前NK細胞的臨床治療主要通過利用細胞因子體外擴增和激活NK細胞，但其受KIR和KAR調節，與機體正常細胞接觸后，KIR能誘導靶細胞上的HLA-Ⅰ類分子基團改變，形成KIR/HLA外環，其中心為ICAM-1/LFA-1，從而形成抑制性免疫突觸［6］。很多腫瘤細胞在丟失經典的HLA-Ⅰ類分子同時，另一類非經典的HLA-Ⅰ類分子表達增加，包括乳腺癌在內均表達高水平的HLA-G和HLA-E分子［7］，這種高表達的HLA-G分子可與抑制性受體結合，抑制NK細胞的殺傷［8］，因而對乳腺癌進行免疫治療，必須激活NK細胞的活性以提高對患者的免疫應答，殺傷腫瘤細胞及阻止腫瘤轉移。

腫瘤免疫監視功能包括天然免疫監視和獲得性免疫監視兩方面，以CD3-、CD16+和CD56+為主要表型特征的NK細胞，直接殺傷MHC-Ⅰ類分子丟失或變異的靶細胞，發揮天然腫瘤免疫監視功能。CD8+CTL細胞殺傷MHC-Ⅰ類分子限制性靶細胞，具有獲得性腫瘤免疫監視功能，正常情況下兩者相互補充和協調，共同抑制腫瘤細胞的發生發展［9］。NK細胞無CD8+CTL細胞殺傷活性復雜的活化過程，能迅速發揮殺瘤效應，因此在腫瘤免疫監視中發揮舉足輕重的作用。乳腺癌具有特殊的免疫學特性，在其發生、發展過程中由NK細胞發揮主要的免疫監視作用［3］。本研究我們采用晚期乳腺癌患者和正常女性自體的NK細胞研究對乳腺癌的抗腫瘤免疫作用，分析腫瘤患者來源NK細胞能否被激活，產生特異性的抗腫瘤免疫作用。結果表明乳腺癌患者和正常女性來源NK細胞的誘導增殖作用無統計學差異，培養到第21天NK細胞計數均達到2.0× 109以上，增殖倍數達到1 000倍以上；且兩者來源NK細胞均表達特有CD16CD56分子，陽性率達80%以上，患者自體NK細胞表型與正常女性比較無統計學差異。

NK細胞發揮特有的天然腫瘤免疫作用已在腫瘤免疫治療和臨床研究中得到開展。乳腺癌組織高表達的HLA-G分子可抑制NK細胞的殺傷活性，對其自身來說，是對其丟失經典HLA-Ⅰ類分子產生不利影響的一種補救措施，使其能逃逸CTL細胞的殺傷，又能逃逸NK細胞的殺傷［10］。同時乳腺癌患者體內免疫系統受到惡性腫瘤細胞抑制，腫瘤細胞營造的免疫微環境，包括調節性細胞因子分泌、抑制性免疫細胞和免疫細胞功能被抑制，均介導腫瘤細胞產生免疫逃避［11］。體外實驗我們研究發現各組對乳腺癌細胞均表現出良好的殺傷作用，晚期患者自體NK細胞同樣具有良好的殺傷效果，而且乳腺癌患者和正常人來源的自體NK細胞的殺傷活性無統計學差異。

本研究晚期乳腺癌患者和正常人來源體外誘導培養獲得的自體NK細胞，流式細胞儀檢測表型，乳腺癌患者自體NK細胞經體外培養后，具有與健康者同樣誘導增殖效果，并表達高表型的CD16CD56分子，很好地被激活增殖。體內體外實驗證實乳腺癌患者自體NK細胞對乳腺癌細胞能引發良好的細胞毒性作用，將有助于采用自體NK細胞將來臨床治療乳腺癌，不會產生免疫排斥反應。

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廣東省科技計劃項目（2011A030400007）。

黃啟明（E-mail：hymeng2000@aliyun.com）

2015-12-08）