乳腺癌組織中Shh基因表達變化及其與術后復發的關系

陳晶，趙璐，宋牧，孫國輝，木拉提·庫爾班（新疆醫科大學第二附屬醫院，烏魯木齊830000）

乳腺癌組織中Shh基因表達變化及其與術后復發的關系

陳晶，趙璐，宋牧，孫國輝，木拉提·庫爾班
（新疆醫科大學第二附屬醫院，烏魯木齊830000）

目的 觀察乳腺癌組織中Shh基因表達變化并探討其與術后復發的關系。方法 留取152例經手術治療的乳腺癌患者腫瘤及癌旁組織，采用實時熒光定量PCR技術檢測乳腺癌及癌旁組織標本中Shh基因表達，患者隨訪截止日期為2015年2月28日，以乳腺癌組織中Shh mRNA相對表達量的中位值2.47為界值，將患者分為高表達組89例和低表達組63例，采用Kaplan-Meier生存分析法分析患者術后無復發生存時間。結果 乳腺癌、癌旁組織中Shh mRNA相對表達量分別為2.48±0.43、1.25±0.29，兩者比較，P＜0.05；乳腺癌組織中Shh mRNA相對表達量與年齡和人類表皮生長因子受體表達有關（P均＜0.05），年齡越小、人類表皮生長因子受體表達陽性，Shh mRNA相對表達量越高；非復發組、復發組乳腺癌組織中Shh mRNA相對表達量分別為1.98±0.42、2.87±0.47，兩組比較，P＜0.05；高表達組、低表達組術后復發率分別為23.6%、12.7%，兩組比較，P＜0.05；Kaplan-Meier生存分析顯示，高表達組、低表達組患者中位無復發生存時間分別為29、59個月，兩組比較，P＜0.05。結論 Shh在乳腺癌組織中呈高表達，且與術后復發有關，Shh高表達可顯著縮短患者術后無復發生存時間。

乳腺腫瘤；Shh基因；復發轉移

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，隨著診療技術的發展，患者預后已得到較大改善，術后5年生存率顯著提高［1］，然而，目前乳腺癌發生機制尚未完全清楚，且對于復發轉移及三陰性乳腺癌治療效果有效［2］。Shh信號通路作為干細胞自我更新的重要調控通路，在干細胞增殖、分化及胚胎發育中發揮重要作用［3］。研究［4］表明，Shh信號通路異常表達與多種惡性腫瘤發生、進展有關，Shh基因作為Shh信號通路主要參與者，與該信號通路激活關系密切。2005年2月～2006年2月，我們采用實時熒光定量PCR技術檢測乳腺癌及癌旁組織標本中Shh基因表達，探討其與乳腺癌復發的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2005年2月～2006年2月于我院經手術治療的乳腺癌患者152例，患者均經術后病理學檢查確診，手術切除乳腺癌及癌旁（距離癌組織≥5 cm）組織標本152例份均保存于液氮中。年齡27～74（53.2±9.8）歲，患者隨訪截止日期2015年2月28日，中位隨訪時間73（4～112）個月，隨訪信息主要通過病歷登記及電話獲得。患者臨床病理特征資料及預后信息均齊全，其中29例患者在隨訪期間出現復發轉移，作為復發組，123例患者未出現復發轉移，作為非復發組。本研究通過醫院倫理委員會批準。

1.2 乳腺癌及癌旁組織標本中Shh基因表達檢測采用實時熒光定量PCR法。取乳腺癌或癌旁組織，研磨后，細胞裂解液裂解后，用TRIzol提取試劑盒提取總RNA，應用紫外分光光度計檢測樣品，取A260/A280＞1.80樣品繼續進行檢測。采用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄為第一模板鏈cDNA，以cDNA為模板用PCR試劑盒進行PCR，Shh及其內參引物序列分別為：Shh引物：上游：5′-ACCGAGGGCTGGGACGAAGA-3′，下游：5′-ATTTGGCCGCCACCGAGTT-3′，β-actin引物：上游：5′-CATCCTGGGTCTGGACCTGG-3′，下游：5′-ATTTGGGGTGCACGATGGAGGG-3′。PCR反應條件：94℃預變性3 min，94℃變性60 s，56℃30 s，74℃30 s，連續進行402循環。每個樣本均設3個復孔。以β-actin為內參，按照2-ΔΔCt法獲得Shh mRNA相對表達量。

1.3 統計學方法 采用SPSS21.0統計軟件。計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，采用Kaplan-Meier生存分析法對患者術后無復發生存時間進行分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Shh基因在乳腺癌和癌旁組織中表達比較乳腺癌及癌旁組織中Shh mRNA相對表達量分別為2.48±0.43、1.25±0.29，兩者比較，P＜0.05（t= 31.312）。

2.2 Shh mRNA表達與乳腺癌患者臨床病理特征的關系 乳腺癌組織中Shh mRNA相對表達量與臨床分期、T分期、N分期、雌激素受體表達和孕激素受體表達無關（P均＞0.05），而與年齡和人類表皮生長因子受體表達有關（P均＜0.05），年齡越小、人類表皮生長因子受體表達陽性，Shh mRNA相對表達量越高。見表1。

表1 Shh mRNA表達與乳腺癌患者臨床病理特征的關系（±s）

表1 Shh mRNA表達與乳腺癌患者臨床病理特征的關系（±s）

臨床病理特征nShh mRNA相對表達量t/FP年齡（歲）≥60422.09±0.28 36～59962.75±0.3417.3940.000 ≤35143.34±0.46臨床分期Ⅰ期692.46±0.39Ⅱ期602.48±0.451.1720.153Ⅲ期232.49±0.47 T分期pT1792.45±0.41 pT2562.46±0.391.0950.274 pT3152.49±0.46 pT422.51±0.47 N分期pN0782.44±0.38 pN1572.47±0.420.8620.627 pN2132.49±0.47 pN342.48±0.45雌激素受體表達陽性892.47±0.420.6720.835陰性632.49±0.48孕激素受體表達陽性782.46±0.410.9530.575陰性742.50±0.47人類表皮生長因子受體表達陽性473.04±0.4911.8720.000陰性1051.96±0.35

2.3 Shh mRNA在乳腺癌組織中表達與術后復發的關系 非復發組、復發組乳腺癌組織中Shh mRNA相對表達量分別為1.98±0.42、2.87±0.47，兩組比較，P＜0.05（t=19.351）。

2.4 Shh在乳腺癌組織中表達對患者術后無復發生存時間的影響 以乳腺癌組織中Shh mRNA相對表達量的中位值2.47為界值，將152例患者分為高表達組89例和低表達組63例，高表達組患者術后復發率為23.6%，低表達組患者術后復發率為12.7%，Kaplan-Meier生存分析顯示，高表達組患者中位無復發生存時間為29（4～95）個月，低表達組患者中位無復發生存時間為59（5～112）個月，log rank檢驗顯示，兩組患者無復發生存時間差異有統計學意義（χ2=11.893，P=0.01），見圖1。

圖1 Shh在乳腺癌組織中表達對患者術后無復發生存時間的影響

3 討論

乳腺癌是對女性健康威脅較大的惡性腫瘤，腫瘤細胞發生浸潤、轉移是造成患者預后不良的重要原因［5］，目前乳腺癌細胞發生浸潤、轉移的具體作用機制尚未完全清楚。Shh信號通路包括分泌型信號糖蛋白Shh和2個跨膜蛋白受體組成的復合體，以及下游Gli效應蛋白［6］，一般情況下，Shh不存在時，該通路處于抑制狀態，當Shh存在時，會導致該信號通路激活，引發Gli蛋白大量表達而調控細胞生長、增殖、分化過程，當Shh信號通路出現異常激活時，會導致細胞增殖異常而引發腫瘤發生［7］。有研究［8］指出，Shh蛋白在胃癌組織中呈高表達，且與腫瘤浸潤、淋巴結轉移有關。本研究顯示，乳腺癌組織中Shh mRNA相對表達量遠高于癌旁組織中，差異有統計學意義，說明Shh基因在乳腺癌組織中呈異常高表達，可能與腫瘤發生有關。進一步分析發現，乳腺癌組織中Shh mRNA相對表達量與臨床分期、T分期、N分期、雌激素受體表達和孕激素受體表達無關，而與年齡和人類表皮生長因子受體表達有關，年齡越小、人類表皮生長因子受體表達陽性，Shh mRNA相對表達量越高，而年齡小、人類表皮生長因子受體過表達則往往預示患者預后不良［9，10］，提示Shh在乳腺癌組織中表達可能與患者預后有關。

本研究結果顯示，非復發組乳腺癌組織中Shh mRNA相對表達量遠低于復發組，差異有統計學意義，說明Shh在乳腺癌組織中表達與乳腺癌患者術后腫瘤復發關系密切。為進一步分析Shh在乳腺癌組織中表達與患者術后復發之間的關系，以Shh mRNA相對表達量的中位值2.47為界值，將患者分為高表達組和低表達祖，結果顯示，高表達組患者術后復發率高于低表達組，Kaplan-Meier生存分析顯示，高表達組患者中位無復發生存時間遠低于低表達組，差異有統計學意義，說明Shh在乳腺癌組織中高表達加速了患者術后復發，顯著縮短了患者無復發生存時間，不利于患者預后，提示Shh可作為乳腺癌患者早期復發的監測指標［11］。

綜上所述，Shh在乳腺癌組織中呈高表達，且與患者術后復發有關，Shh高表達可顯著縮短患者術后無復發生存時間，Shh可能對乳腺癌患者預后評估有參考意義。

［1］Sinn P，Aulmann S，Wirtz R，et al.Multigene assays for classification，prognosis，and prediction in breast cancer：a critical review on the background and clinical utility［J］.Geburtshilfe Frauenheilkd，2013，73（9）：932-940.

［2］Alexandrova E，Sergieva S，Kostova P，et al.Ipsilateral in-breast tumor recurrence after breast conserving therapy：true recurrence versus new primary tumor［J］.J BUON，2015，20（4）：1001-1008.

［3］He X，Zhang L，Chen Y，et al.The G protein α subunit Gαs is a tumor suppressor in Sonic hedgehog-driven medulloblastoma［J］. Nat Med，2014，20（9）：1035-1042.

［4］Jiang WG，Ye L，Ruge F，et al.Expression of Sonic Hedgehog （SHH）in human lung cancer and the impact of YangZheng XiaoJi on SHH-mediated biological function of lung cancer cells and tumor growth［J］.Anticancer Res，2015，35（3）：1321-1331.

［5］Ozturk T，Kucukhuseyin O，Eronat AP，et al.Preliminary Study： Prominent miRNAs of breast malignant tissues compared to normal tissues in Turkish patients with breast cancer［J］.Anticancer Res，2015，35（10）：5425-5432.

［6］Mille F，Tamayo-Orrego L，Lévesque M，et al.The Shh receptor Boc promotes progression of early medulloblastoma to advanced tumors［J］.Dev Cell，2014，31（1）：34-47.

［7］Zhao X，Ponomaryov T，Ornell KJ，et al.Ras/Mapk activation drives resistance to Smo inhibition，metastasis，and tumor evolution in Shh pathway-dependent tumors［J］.Cancer Res，2015，75 （17）：3623-3635.

［8］Wan J，Zhou J，Zhao H，et al.Sonic hedgehog pathway contributes to gastric cancer cell growth and proliferation［J］.Biores Open Access，2014，3（2）：53-59.

［9］Piccart M，Hortobagyi GN，Campone M，et al.Everolimus plus exemestane for hormone-receptor-positive，human epidermal growth factor receptor-2-negative advanced breast cancer：overall survival results from BOLERO-2［J］.Ann Oncol，2014，25（12）：2357-2362.

［10］Giordano SH，Temin S，Kirshner JJ，et al.Systemic therapy for patients with advanced human epidermal growth factor receptor 2-positive breast cancer：American Society of Clinical Oncology clinical practice guideline［J］.J Clin Oncol，2014，32（19）：2078-2099.

［11］Ge X，Lyu P，Gu Y，et al.Sonic hedgehog stimulates glycolysis and proliferation of breast cancer cells：Modulation of PFKFB3 activation［J］.Biochem Biophys Res Commun，2015，464（3）：862-868.

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.25.023

R737.9

B

1002-266X（2016）25-0067-03

孫國輝（E-mail：694826581@qq.com）

2015-12-05）