梓葛凍干粉針對腦微血管內皮細胞缺氧/復氧損傷的保護作用

尚遠宏,田金鳳,王　敏,李松青,徐曉玉

(1.攀枝花學院 干熱河谷特色生物資源研發(fā)四川省高校重點實驗室,四川攀枝花 617000;2.西南大學 藥學院 重慶市藥效評價工程技術研究中心,重慶 400716)

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梓葛凍干粉針對腦微血管內皮細胞缺氧/復氧損傷的保護作用

尚遠宏1,2,田金鳳1,王敏1,李松青1,徐曉玉2,*

(1.攀枝花學院 干熱河谷特色生物資源研發(fā)四川省高校重點實驗室,四川攀枝花 617000;2.西南大學 藥學院 重慶市藥效評價工程技術研究中心,重慶 400716)

探討梓葛凍干粉針對腦微血管內皮細胞(BMECs)缺氧/復氧損傷的保護作用。取新生10 d的SD大鼠乳鼠,分離、培養(yǎng)腦皮層微血管原代內皮細胞,并利用DMEM無糖培養(yǎng)基、三氣培養(yǎng)箱缺氧容器(缺糖缺氧2 h)及5% CO2培養(yǎng)箱復氧培養(yǎng)24 h復制缺氧/復氧模型,MTT法BMECs細胞活力,Western blot法檢測MMP-9的蛋白表達。結果顯示,與模型組相比,梓葛凍干粉針(49.00、98.00 μg·mL-1)能促進缺氧/復氧模型中BMECs增殖;梓葛凍干粉針(24.50、49.00、98.00 μg·mL-1)能顯著抑制BMECs細胞中MMP-9 蛋白表達升高(p<0.05);提示梓葛凍干粉針對腦微血管內皮細胞損傷的保護作用可能與降低MMP-9蛋白表達有關。

梓葛凍干粉針,BMECs,MMP-9,缺氧/復氧損傷

梓葛凍干粉針主要由《千金方》中方劑“羌活湯”中藥食同源的葛根提取的葛根素和熟地黃提取的梓醇組成,并由西南大學中藥研究所依據(jù)食療養(yǎng)生防病思路自主研發(fā)的一個具有抗腦缺血作用的制劑(專利公開號CN101574361A),具有改善腦部微循環(huán)的作用[1]。

缺氧/復氧損傷模型是氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation,OGD)模型和復氧模型的結合,是模擬缺血再灌注情況較理想的體內模型。腦微循環(huán)由微血管和微血流組成[2],當缺血再灌注時,會加劇損傷缺血區(qū)微血管,增加管壁通透性。而影響腦微循環(huán)基本以血管內皮細胞為媒介來實現(xiàn)[3],其中金屬基質蛋白(matrix metalloprotein-9,MMP-9)主要在內皮細胞、膠質細胞、神經元和白細胞表達,幾乎能降解細胞外基質中的各種蛋白成分[4];MMP-9能夠通過降解血管內皮細胞的基底膜來損傷血管內皮細胞,導致微血管壁通透性增強。因此,實驗中采用原代培養(yǎng)大鼠腦微血管內皮細胞(brain microvascular endothelial cells,BMECs),復制腦微血管內皮細胞的缺氧/復氧損傷模型來模擬腦缺血再灌注損傷,研究梓葛凍干粉針對腦微血管內皮細胞損傷的保護作用。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

取10日齡新生SD大鼠幼鼠體質量(8±2)g,SPF級,由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心供應(合格證號:SCXK(渝)2007-0001),于西南大學藥學院SPF級實驗動物中心飼養(yǎng)(許可證號:SYXK(渝)2009-0002),用于獲取腦微血管原代內皮細胞。

胰蛋白酶美國Amresco公司分裝;DMEM/F12培養(yǎng)基粉美國GIBCO公司;胎牛血清美國HyClone公司;MTT美國Amersco公司分裝;牛血清白蛋白美國Genview公司分裝;尼莫地平德國拜耳醫(yī)藥保健有限公司;葛根素注射液成都天臺山制藥有限公司;梓葛凍干粉針西南大學中藥研究所研制;MMP-9多克隆抗體北京博奧森公司,抗β-actin多克隆抗體北京博士德生物技術公司;蛋白marker加拿大Fermentas公司;ECL試劑盒美國Pierce生物技術公司;脫脂奶粉上海生工生物工程有限公司;其他化學試劑均為成都科龍化工試劑廠。

Ziss IX71倒置相差顯微鏡德國蔡司公司;CB150三氣培養(yǎng)箱德國BINDER公司;EL204電子天平美國梅特勒-托利多公司;3410立式超低溫冰箱美國thermo公司;6000CO2恒溫培養(yǎng)箱美國NACPO公司;SW-CJ-2FD超凈工作臺蘇州金凈公司;移液器德國Eppendorf公司;TDL-50B低速臺式離心機上海安亭科學儀器廠;6-96孔培養(yǎng)板美國Costar公司;25～75 cm2培養(yǎng)瓶美國Costa公司;YA121001血球計數(shù)板北京鼎國生物公司;SW-CJ-ZF凈化細胞培養(yǎng)系統(tǒng)重慶新雅空調凈化廠。

1.2腦皮層微血管內皮細胞分離、培養(yǎng)與純化

參照文獻方法[5-6]。取10日齡新生大鼠,頸椎脫臼處死后,用75%乙醇浸泡3～5 min消毒,T字形剪開頭部皮膚和顱骨,無菌取出大腦,置冷的D-Hank’s液的培養(yǎng)皿中;將大腦半球在滅菌干濾紙上緩慢滾動以吸除軟腦膜及腦膜大血管后置于無菌的含冷D-Hank’s液玻璃培養(yǎng)皿中,體視顯微鏡下仔細去除大腦白質、殘余大血管和軟腦膜,保留大腦皮質;用D-Hank’s液漂洗后剪碎成直徑1 mm大小并移入15 mL離心管中,1200 r/min離心3 min,棄上清液;在沉淀的組織中按1∶1的量加入25%牛血清白蛋白后反復吹懸,2500 r/min離心8 min,重復離心2次;離心的血管沉淀按1∶2加0.1%的Ⅱ型膠原酶,37℃消化40 min,吹懸后移入離心管,1200 r/min離心5 min,沉淀中加入適量完全培養(yǎng)基混懸后按1×104個血管段/mL密度接種于用1%明膠包被的塑料培養(yǎng)瓶中;置飽和濕度、37℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng),24 h后第1次換液,以后每2 d換一次液。第7 d細胞基本融合后,進行消化傳代純化。以0.25%胰酶-0.02% EDTA消化,傳代培養(yǎng),以2代細胞用于實驗。

1.3缺氧/復氧模型的建立

2代的內皮細胞常規(guī)培養(yǎng)48 h后(六孔板中每孔細胞覆蓋不低于90%,每孔細胞液為1.5 mL),棄原液,用0.01 mol/L PBS液沖洗2次,將(除正常組)所有孔換成DMEM無糖培養(yǎng)基(1.5 mL),放入5% CO2+1% O2+94% N2三氣培養(yǎng)箱缺氧容器中,37℃培養(yǎng)2 h后取出培養(yǎng)板(缺糖缺氧2h),將無糖培養(yǎng)液均換成正常20%血清培養(yǎng)液后于37℃、5% CO2條件下復氧培養(yǎng)24 h。

1.4實驗分組及給藥方案

實驗分為正常對照組、缺氧/復氧模型組、30.00 μg·mL-1葛根素注射液組、2.00 μg·mL-1尼莫地平組和24.50、49.00、98.00 μg·mL-13個劑量梓葛凍干粉針組。正常對照組:細胞在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng);缺氧-復氧模型組:細胞在給予上述缺氧處理2 h后再于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h(20%血清培養(yǎng)基);給藥組:在復氧時分別加入30.00 μg·mL-1葛根素注射液、2.00 μg·mL-1尼莫地平和24.50、49.00、98.00 μg·mL-13個劑量梓葛凍干粉針,其余過程同模型組。

葛根素注射液、梓葛凍干粉針和尼莫地平均以20%血清培養(yǎng)基溶解至濃度。在復氧時,各給藥1次(1.5 mL)。每組均設復孔3個。

1.5BMECs細胞活力的測定

參照文獻方法[7],采用MTT法。吸棄培養(yǎng)基,PBS洗3次,96孔板每孔加入5 mg·mL-1的MTT溶液各10 μL,于培養(yǎng)箱中37℃、5% CO2條件下孵育4 h后,棄去MTT液,每孔加入100 μL的DMSO,振蕩器輕輕混勻10 min后,以酶標儀、490 nm波長檢測OD值。

1.6Western blot法檢測MMP-9的蛋白表達

樣本處理:取需裂解的細胞,用PBS液潤洗細胞2次,吸干PBS液后,6孔板孔底按每孔加入預冷的RIPA 100 μL的細胞裂解液(在使用前數(shù)分鐘內加入PMSF且使其終濃度為1 mmol/L),加入裂解液后的細胞即刻放置冰上并不斷搖晃使其充分接觸裂解液,10 min后分別用細胞刮刮下細胞,用移液器吸入已編號的1.5 mL離心管中,裂解液于4℃,12000 r/min離心15 min后收集上清液,分裝,-80℃保存(備用)。參照文獻方法[8],采用聚丙烯酰胺凝膠電泳操作。MMP-9用8%分離膠,進行電泳,轉膜,ECL顯影,將膠片用Bio-Rad公司圖像分析軟件進行分析,測定目的蛋白條帶和內參β-actin蛋白條帶的累積光密度值(IOD值)。

1.7統(tǒng)計學分析

2　結果與分析

2.1缺氧/復氧模型中細胞生長形態(tài)

正常對照組內皮細胞單層鋪滿孔底,呈漩渦狀排列。缺糖缺氧2 h后,模型組的細胞均不同程度地受到影響,微血管內皮細胞胞體回縮,部分細胞胞體開始變圓,細胞間連接疏松。復氧24 h后,模型組的細胞間連接更疏松,出現(xiàn)部分胞體收縮和脫落,而用藥組均不同程度地使細胞間隙變小,少量胞體收縮變圓,且變圓的細胞仍未脫落。見圖1。

圖1　梓葛凍干粉針對微血管內皮細胞在缺氧/復氧損傷前后形態(tài)變化的影響(100×)Fig.1　Effects of Zige lyophilized powder on morphology changes in BMECs hypoxia-reoxygenation injury(100×)注:A、正常對照組;B、模型組(缺糖缺氧2 h時);C、模型組(復氧24 h時);D、梓葛凍干粉針49.00 μg·mL-1組(復氧24 h時)。

2.2梓葛凍干粉針促進缺氧/復氧模型中BMECs增殖

缺氧/復氧損傷后,與正常組相比,模型組OD值顯著降低(p<0.01),顯示造模成功;與模型組相比,葛根素注射液組(30.00 μg·mL-1),尼莫地平組(2.00 μg·mL-1),梓葛凍干粉針98.00 μg·mL-1和49.00 μg·mL-1組均顯著提高OD值(p<0.05,p<0.01);與模型組相比,梓葛凍干粉針24.50 μg·mL-1組無顯著性差異。見表1。

2.3梓葛凍干粉針抑制BMECs缺氧/復氧損傷下MMP-9蛋白表達的升高

經Western blot法檢測,正常對照組BMECs細胞中有少量MMP-9 蛋白表達;缺氧/復氧損傷下,與正常對照組相比,復氧24 h后,模型組的BMECs細胞中MMP-9 蛋白表達升高(p<0.01),顯示造模成功。各藥物組均能顯著抑制BMECs細胞中MMP-9 蛋白表達升高(p<0.05,p<0.01),提示梓葛凍干粉針(24.50、49.00、98.00 μg·mL-1)對血管內皮細胞完整性具有保護作用。見圖2。

表1　梓葛凍干粉針對缺氧/復氧損傷BMECs細胞活力的影響

注:與正常對照組比較# #p<0.01;與模型組比較* p<0.05,** p<0.01,圖2同。

圖2　梓葛凍干粉針對BMECs缺氧/復氧損傷下中MMP-9蛋白表達的影響Fig.2　The protein expression levels of MMP-9 on BMECs after hypoxia-reoxyge-nation injury注:A、BMECs缺氧/復氧損傷下各實驗組MMP-9蛋白表達;B、BMECs缺氧/復氧損傷下MMP-9蛋白相對表達趨勢。

3　討論

腦微循環(huán)由微血管和微血流組成,對維持組織器官的功能和內環(huán)境平衡起著重要的作用,是保證腦組織形態(tài)結構、功能代謝的關鍵[3]。在腦缺血再灌注疾病發(fā)生時,改善血管的通透性及其相關因素是至關重要[9]。微血管通透性增高的兩個途徑是內皮細胞膜通透性的升高和內皮細胞的形態(tài)發(fā)生變化導致內皮細胞間彌散通道的開放[10]。血管內皮細胞的金屬基質蛋白(MMP-9)和細胞緊密連接蛋白(Occludin、Claudin-5和ZO-1)的結構、功能異常與微血管通透性破壞密切相關[11-12]。其中,MMP-9激活時能夠通過降解血管內皮細胞的基底膜來損傷血管內皮細胞,引起細胞壁通透性增強或開放,缺血后腦組織MMP-9活性增高是缺血后腦損傷的重要機

制之一[13]。有研究表明腦缺血時基質金屬蛋白酶的水平增加,且缺血的一側半球增加程度比對側明顯,給予外源性組織金屬蛋白酶抑制劑和抗基質金屬蛋白酶的單克隆抗體可減輕缺血性腦損傷[14]。實驗中,梓葛凍干粉針(24.50、49.00、98.00 μg·mL-1)可抑制BMECs細胞中MMP-9蛋白表達的升高,達到減輕細胞損傷的效果,從而保護微血管完整性,降低微血管通透性,可能改善腦部微循環(huán),這與已發(fā)表的其能改善腦微循環(huán)障礙相吻合[1],說明其在腦缺血再灌注損傷干預中具有潛在應用價值。

4　結論

本文初步證實梓葛凍干粉針對血管內皮細胞完整性的保護作用機制可能與降低MMP-9蛋白表達有關,為腦微血管介導的腦保護作用提供參考,也可能為擴大梓葛凍干粉針的臨床適應證提供參考。

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Protective effect of Zige lyophilized powder on brain microvascular endothelial cells after hypoxia-reoxygenation injury

SHANG Yuan-hong1,2,TIAN Jin-feng1,WANG Min1,LI Song-qing1,XU Xiao-yu2,*

(1.Key Laboratory of Dry-hot Valley Characteristic Bio-Resources Development at university of Sichuan Province,Panzhihua University,Panzhihua 617000,China; 2.College of Pharmacetical Sciences,Southwest University,Chongqing Engineering Research Center for Pharmacodynamics Evaluation,Chongqing 400716,China)

To investigate the protective effect of Zige lyophilized powder on brain microvascular endothelial cells(BMECs) after hypoxia-reoxygenation injury.BMECs of the 10 d rats were isolated and cultured,the model of BMECs with the hypoxia-reoxygenation injury was estabished by DMEM sugar-free medium,three gas incubator oxygen container(lacking oxygen and sugar for 2 h),and 5% CO2incubator for 24 h after oxygen training.The proliferation of endothelial cells was detected by MTT method.The protein expression levels of MMP-9 were detected by WB method.Zige lyophilized powder(49.00,98.00 μg·mL-1)could promote BMECs proliferation in hypoxia-reoxygenation model.The increasing level of MMP-9 protein in a hypoxia-reoxygenation injury on cultured BMECs was inhibited significantly by Zige lyophilized powder(24.50,49.00 and 98.00 μg·mL-1)(p<0.05).It showed that the possible mechanism of Zige lyophilized powder for injection on protecting the cell integrity would be associated with the decreasing MMP-9 protein expression.

Zige lyophilized powder for injection;BMECs;MMP-9;Hypoxia-reoxygenation injury

2015-08-27

尚遠宏(1980-)，男，博士，研究方向：中藥藥理和食品研究，E-mail：shyh611@126.com。

徐曉玉(1958-)，女，碩士，教授，研究方向：中藥藥理，E-mail：xuxiaoyu@swu.edu.cn。

國家青年基金項目(31402237);國家自然基金面上項目(81473549);攀枝花市社會發(fā)展科技計劃項目(2014TX-10-3);四川省教育廳重點基金項目(14ZA0345，15ZA0370);四川省高校重點實驗室開放基金項目(GR-2013-E-02,GR-2015-E-01)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)07-0358-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.07.061