淫羊藿補骨脂復合膠囊毒理學研究

尹利端,彭　堅,尹利昂,王立志

(1.煙臺新時代健康產業有限公司,山東煙臺 264006;2.北京市經濟管理學校,北京 100142;3.中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003)

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淫羊藿補骨脂復合膠囊毒理學研究

尹利端1,彭堅2,尹利昂3,王立志1

(1.煙臺新時代健康產業有限公司,山東煙臺 264006;2.北京市經濟管理學校,北京 100142;3.中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003)

采用小鼠經口急性毒性實驗、遺傳毒性實驗(Ames實驗、小鼠骨髓微核實驗、精子畸形實驗)和大鼠30 d喂養實驗,對淫羊藿補骨脂復合膠囊進行毒理學研究。結果表明,受試樣品對雌、雄小鼠的最大耐受量(MTD)均大于20.0 g/kg·bw,屬無毒級。Ames實驗、小鼠骨髓微核實驗和精子畸形實驗結果均呈陰性。30 d喂養實驗中,各組大鼠生長發育良好,血液學指標、生化指標、主要臟器系數、組織病理學檢查均未出現異常。在實驗劑量下,淫羊藿補骨脂復合膠囊是安全的。

淫羊藿,毒理學研究,功能食品

骨質疏松癥是以骨量降低,骨組織顯微結構發生退變,導致骨脆性增加,骨強度下降,最終使骨折危險性增大為特征的一種老年性疾病。骨質疏松癥是老年人和絕經后婦女的常見病,據調查顯示,截至2013年10月,我國中老年人的骨質疏松患者病人數約為5312.6萬,且每年有26.3萬新增患者[1]。隨著我國老齡化人群的不斷增加,預計至2025年骨質疏松癥患病人群將可能增長至總人口的13.3%,將嚴重影響老年人生活質量[2]。隨著人口壽命的延長和老齡化社會的到來,正有越來越多的老年人健康受到骨質疏松癥的威脅。骨質疏松癥患者長期服用藥物會帶來一定的副作用,而具有預防骨質疏松癥作用的功能食品有著相對較高的食用安全性,增加骨密度功能食品已經成為近年來行業研究的熱點之一。

淫羊藿為小檗科植物淫羊藿、箭葉淫羊藿、柔毛淫羊藿或朝鮮淫羊藿的干燥葉,補骨脂是豆科植物補骨脂的干燥成熟果實[3]。淫羊藿、補骨脂都具有悠久的中醫藥應用歷史,其應用于骨病防治的功效在諸多本草典籍中均有記載。據《中華人民共和國藥典》稱,淫羊藿具有補腎陽、強筋骨、祛風濕的功效,補骨脂具有溫腎助陽作用[3]。現代研究表明,淫羊藿有雌激素樣作用,具有防治骨質疏松癥的功效[4-7]。補骨脂能夠增加骨密度,亦具有預防骨質疏松的保健作用[8-11]。氨基葡萄糖是軟骨成分蛋白聚糖合成的前體物質,具有促進關節軟骨修復、改善軟骨組織代謝和關節潤滑的功能[12-13]。淫羊藿補骨脂復合膠囊以淫羊藿提取物、補骨脂提取物為主要原料,同時復配氨基葡萄糖鹽酸鹽,是針對骨質疏松人群研制的一種功能食品。為評價淫羊藿補骨脂復合膠囊的食用安全性,以進一步為產品開發提供科學參考,本研究參照《食品安全性毒理學評價程序》[14]、《保健食品檢驗與評價技術規范》[15],對其進行了毒理學研究。

1　材料和方法

1.1受試樣品

淫羊藿補骨脂復合膠囊規格為0.3 g/粒,其制備方法為:將符合中國藥典質量要求的淫羊藿、補骨脂飲片分別粉碎,過10目篩,按4∶1的質量比將其混合均勻,得混合物,向此混合物中添加10倍量純化水,85～90℃提取2 h,共提取2次,合并2次提取液,經過濾、減壓濃縮、干燥后得淫羊藿與補骨脂混合提取物;將此混合提取物與氨基葡萄糖鹽酸鹽、淀粉按照1∶1.5∶1的質量比混合均勻后裝膠囊。

淫羊藿補骨脂復合膠囊人體推薦用量為每日2次,每次3粒,成人體重按60 kg計算,折合劑量為0.03 g/kg·bw。

1.2實驗動物

SPF級昆明種小鼠和SD大鼠由中科院上海實驗動物中心提供,實驗動物在實驗前適應性喂養7 d,動物飼養室溫度(22±2)℃,相對濕度50%±10%。

1.3主要儀器與試劑

SYSmesXT-1800i全自動血球計數儀日本希思曼公司;AU680全自動生化分析系統貝克曼庫爾特公司;光學顯微鏡日本Olympus株式會社;電子天平日本島津公司;離心機上海盧湘儀器有限公司;電熱恒溫水浴鍋北京長安科學儀器廠。

對二甲基氨基苯重氮磺酸鈉(敵克松)Sigma公司;疊氮鈉、2-氨基芴(2-AF)、1,8-二羥蒽醌Fluka公司;環磷酰胺上海華聯制藥有限公司,化學純;甲醇、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉廣東汕頭市西隴化工有限公司,均為分析純。

1.4實驗方法

1.4.1小鼠急性毒性實驗選用健康昆明種小鼠20只,體重18～22 g,雌雄各半。將受試樣品用蒸餾水配制成0.5 g/mL的溶液,小鼠空腹16 h后,以20 mL/kg·bw容量灌胃2次,間隔為4 h,總灌胃劑量為20.0 g/kg·bw,連續觀察14 d,記錄小鼠的中毒表現及死亡情況。

1.4.2遺傳毒性實驗

1.4.2.1Ames實驗采用經鑒定符合要求的鼠傷寒沙門菌組氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102四株實驗菌進行實驗,用多氯聯苯誘導的大鼠肝勻漿(S9)作為體外代謝活化系統。在無菌條件下,將受試樣品用滅菌蒸餾水稀釋成不同劑量后,與瓊脂、實驗菌液、S9混合液混合倒入平皿中。平皿中受試樣品最終劑量分別為5000、1000、200、40、8 μg/皿,每個劑量組做3個平皿,同時設空白對照、溶劑對照和陽性對照(敵克松、疊氮鈉、2-AF、1,8-二羥蒽醌,劑量分別為50、1.5、10、50 μg/皿)。均包括加S9和不加S9兩種情況。平皿37℃培養48 h,計數每皿回變菌落數。如果受試樣品回變菌落數是自發回變菌落數的2倍以上,并有劑量-反應關系者則定為陽性。整套實驗在相同條件下重復一次。

1.4.2.2小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核實驗選用健康昆明種小鼠50只,體重25～30 g,隨機分為5組,每組10只,雌雄各半。設陰性對照組(蒸餾水)、陽性對照組(環磷酰胺,40 mg/kg·bw)和3個實驗劑量組分別為2.5、5.0、10.0 g/kg·bw。受試樣品劑量組配制濃度分別為0.125、0.25、0.50 g/mL。各組灌胃量均為20 mL/kg·bw,灌胃2次,間隔24 h。末次給予受試物6 h后,頸椎脫臼處死動物,取股骨骨髓加小牛血清混勻,常規涂片、固定,Giemsa染色制片。鏡檢觀察,每鼠計數1000個嗜多染紅細胞(PCE)的微核數,微核率以千分率計,在計數嗜多染紅細胞(計數200個PCE)時同時計數成熟紅細胞(NCE)數,計算PCE/NCE值,并進行統計分析。

1.4.2.3小鼠精子畸形實驗選用雄性小鼠25只,體重30～35 g,隨機分為5組,每組5只。陰性對照組(蒸餾水)、陽性對照組(環磷酰胺40 mg/kg·bw)和3個實驗劑量組分別為2.5、5.0、10.0 g/kg·bw。將配制的不同濃度樣品按20 mL/kg·bw分別對各組動物灌胃。每日1次,連續5 d。末次灌胃后30 d處死動物,取附睪制片,染色,鏡檢觀察,每鼠計數1000個精子的畸形數,計算精子畸形發生率,并進行統計分析。

1.4.330 d喂養實驗選用健康大鼠80只,體重60～80 g,隨機分4組,每組20只,雌雄各半。受試樣品按人體推薦量的25、50、100倍設0.75、1.5、3.0 g/kg·bw 3個劑量組,另設陰性對照組(蒸餾水)。受試樣品用蒸餾水配制濃度分別為0.05、0.1、0.2 g/mL,以15 mL/kg·bw灌胃,陰性對照組灌胃等體積蒸餾水,單籠喂養,自由進食,連續30 d。每天觀察并記錄動物的一般情況、中毒表現和死亡情況。每周稱1次體重和2次食物攝入量,計算每周及總的食物利用率。給予受試樣品30 d后,禁食16 h處死動物,檢測其血液學指標、血生化學指標、臟器系數,并進行組織病理學檢查。

1.5實驗數據統計

采用SPSS軟件進行實驗數據統計和方差分析。p<0.05表示具有顯著性差異。

2　結果與分析

2.1急性經口毒性實驗

將淫羊藿補骨脂復合膠囊以20.0 g/kg·bw的劑量給小鼠灌胃后,觀察14 d,雌、雄小鼠均未見明顯中毒癥狀,也無死亡。將受試動物處死進行解剖檢查,肝臟、脾臟、腎臟、心臟、肺、胃、腸等主要臟器均未見明顯異常改變。根據急性毒性分級標準,當樣品對實驗動物的最大耐受量大于15 g/kg·bw時屬無毒級[16]。本受試樣品對雌、雄小鼠的最大耐受量均大于20.0 g/kg·bw,故屬無毒級。

表1　淫羊藿補骨脂復合膠囊第一次Ames實驗結果±SD)

注:**表示與陰性對照組比較,具有極顯著性差異(p<0.01),表2～表4同。

表2　淫羊藿補骨脂復合膠囊第二次Ames實驗結果±SD)

2.2遺傳毒性實驗

2.2.1Ames實驗Ames實驗結果見表1、表2。由表1、表2可知,兩次實驗自發回變菌落數均在正常范圍,受試樣品各劑量組回變菌落數均未超過自發回變菌落數的2倍,亦無劑量-反應關系,說明在加與不加S9時,受試樣品對鼠傷寒沙門菌TA97、TA98、TA100、TA102四株實驗菌株均未呈現致突變作用。

2.2.2小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核實驗小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核實驗結果見表3。由表3可知,以2.5、5.0、10.0 g/kg·bw的劑量對小鼠灌胃,受試樣品對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率未產生明顯改變,各劑量組微核率與陰性對照組比較不具有顯著性差異(p>0.05),而環磷酰胺陽性對照組與陰性對照組比較有極顯著性差異(p<0.01),表明受試樣品對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率無影響,即受試樣品小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核實驗結果為陰性。

表3　淫羊藿補骨脂復合膠囊對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率的影響

2.2.3小鼠精子畸形實驗小鼠精子畸形實驗結果見表4。由表4可知,以2.5、5.0、10.0 g/kg·bw的劑量給小鼠灌胃受試樣品,各劑量組小鼠精子畸形率與陰性對照組接近,不具有顯著性差異(p>0.05),而環磷酰胺陽性對照組與陰性對照組比較,具有顯著性差異(p<0.01),表明受試樣品對小鼠精子無致畸形作用。

表4　淫羊藿補骨脂復合膠囊對小鼠精子畸形率的影響

2.3大鼠30 d喂養實驗

2.3.1淫羊藿補骨脂復合膠囊對大鼠體重及食物利用率的影響以0.75、1.5、3.0 g/kg·bw的劑量連續對大鼠灌胃受試樣品30 d,實驗周期內各劑量實驗動物生長狀況良好,體重逐周增長,未見中毒體征及死亡。動物體重增加量、進食量和食物利用率見表5。由表5可知,各劑量組動物體重增加量、進食量和食物利用率與陰性對照組比較,均無顯著性差異(p>0.05),表明受試樣品對大鼠體重、進食量和食物利用率均無影響。

表5　淫羊藿補骨脂復合膠囊對大鼠體重、進食量和食物利用率的影響±SD)

2.3.2淫羊藿補骨脂復合膠囊對大鼠血液學指標的影響以0.75、1.5、3.0 g/kg·bw的劑量連續對大鼠灌胃受試樣品30 d后,測定各劑量組大鼠血液學指標紅細胞計數、血紅蛋白、白細胞計數及其分類。測定結果見表6。由表6可知,各劑量組大鼠血液學指標均在正常范圍,與陰性對照組比較均無顯著性差異(p>0.05),表明受試樣品對大鼠血液學指標無影響。

表6　淫羊藿補骨脂復合膠囊對大鼠血液學檢指標的影響±SD)

2.3.3淫羊藿補骨脂復合膠囊對大鼠血生化指標的影響以0.75、1.5、3.0 g/kg·bw的劑量連續對大鼠灌胃受試樣品30 d后,測定各劑量組大鼠血生化指標谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、總蛋白、白蛋白、甘油三酯、膽固醇、血糖、尿素氮、肌酐。測定結果見表7。由表7可知,各劑量組大鼠血生化指標均在正常范圍內,與陰性對照組比較均無顯著性差異(p>0.05),表明受試樣品對大鼠血生化指標無影響。

2.3.4大體解剖及組織病理學檢查結果各劑量組大鼠大體檢查未見異常,雌、雄大鼠的肝臟、脾臟、腎臟、睪丸、卵巢的重量及臟體比與陰性對照組比較,均無顯著性差異(p>0.05)。對高劑量組和陰性對照組大鼠主要臟器進行組織病理學檢查,陰性對照組(雌1/10只)、高劑量組(雄1/10只)觀察到肝小葉有點狀的炎細胞浸潤灶。由于肝臟病變程度較輕且無組間特異性分布,考慮與動物質量有關。腎、脾、胃、十二指腸、卵巢、睪丸等臟器未見明顯異常。與陰性對照組相比,實驗組動物未出現有意義的病理改變。

表7　淫羊藿補骨脂復合膠囊對大鼠血生化指標的影響±SD)

3　結論

淫羊藿補骨脂復合膠囊對雌、雄小鼠最大耐受量均大于20.0 g/kg·bw,根據急性毒性分級標準,屬無毒級。本研究進行的三項遺傳毒性實驗(Ames實驗、小鼠骨髓細胞微核實驗、小鼠精子畸形實驗)均呈陰性,表明淫羊藿補骨脂復合膠囊無遺傳毒性。在大鼠30 d喂養實驗中,動物生長發育良好,動物的體重、進食量、食物利用率、血液學指標、血生化學、主要臟器系數和器官組織形態等均未出現異常變化。綜合本研究結果,在實驗劑量下,淫羊藿補骨脂復合膠囊作為功能食品是安全無毒的。

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Toxicological study on compound capsule of epimedium and psoraleae

YIN Li-duan1,PENG Jian2,YIN Li-ang3,WANG Li-zhi1

(1.Yantai New Era Health Industry Co.,LTD,Yantai 264006,China; 2.Beijing Economic Management School,Beijing 100142,China; 3.College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

Acute toxicity test in mice,genetic toxicity tests(Ames test,micronucleus test of bone marrow and sperm abnormality in mice),and 30-days feeding test in rats were conducted to study toxicity of compound capsule of epimedium and psoraleae.The results showed that the MTD of the tested sample to the female and male mice were more than 20.0 g/kg·bw,so compound capsule of epimedium and psoraleae was no toxicity.Ames test,bone marrow micronucleus test and sperm abnormality test in mice were all negative.In 30-day feeding test,all groups of rats of different doses grew well,hematology indexes,blood biochemistry indexes,main organ coefficient and histopathological examination were all normal.It was concluded that compound capsule of epimedium and psoraleae was safe under the test dose.

epimedium;toxicological study;functional foods

2015-09-02

尹利端(1979-)，男，碩士，工程師，研究方向：功能食品的研究、開發與產業化，E-mail:yinduan@sohu.com。

TS201.6

A

1002-0306(2016)07-0350-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.07.059