雜糧蛹蟲草菌絲共生體中蟲草素的優化提取及測定

常正姣,韓　萍,劉利娥,許艷麗,蔣永紅,王文寧

(鄭州大學 公共衛生學院,河南鄭州 450001)

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雜糧蛹蟲草菌絲共生體中蟲草素的優化提取及測定

常正姣,韓萍*,劉利娥,許艷麗,蔣永紅,王文寧

(鄭州大學 公共衛生學院,河南鄭州 450001)

目的:探討雜糧蛹蟲草菌絲共生體中蟲草素的最優提取條件,并比較了不同光照時長對蟲草素含量的影響,為其工藝條件的優化和綜合利用提供依據。方法:采用單因素結合響應曲面法優化蟲草素的水浴提取條件,高效液相色譜法測定蟲草素含量。結果:最優水浴提取條件為:浸提時間6.59 h、浸提溫度81.9℃、料液比1∶90,此條件下蟲草素含量為6.0143mg/g;不同光照時長條件下蟲草素含量為3.8988～11.9629mg/g,不同光照時長間差異具有統計學意義(p=0.000)。結論:實驗確定了蟲草素水浴提取的最優條件,并得出不同光照時長對蟲草素含量有顯著影響,為進一步優化雜糧蛹蟲草菌絲共生體的培養條件提供參考依據。

雜糧蛹蟲草菌絲共生體,蟲草素,響應面法,高效液相色譜法,光照時長

蟲草素是蛹蟲草重要生物活性成分之一,具有調節血糖[1]、抑菌[2]、抗腫瘤[3-4]、調節免疫力[5]等作用。目前,蟲草素主要由蛹蟲草培養物分離提取獲得,一般通過菌種選育和培養條件優化來提高蟲草素含量。蛹蟲草的人工培養受多種條件的影響,如培養基組成、溫度、光照、pH等的影響,其中光照時長是影響蛹蟲草生長發育的一個重要因素。已有研究表明,適宜的光照時長可提高蛹蟲草菌絲體對基質的利用率和促進菌絲體的轉色及生長,并可促進腺苷和蟲草素的合成[6-8]。

以麥仁、糙米、大豆、奶粉為固體雜糧培養基培養蛹蟲草真菌,得到被蛹蟲草真菌生態轉化的雜糧培養基和菌絲體共存的結構整體,即為雜糧蛹蟲草菌絲共生體。本實驗以不同光照時長下雜糧蛹蟲草菌絲共生體為研究對象,采用單因素結合響應曲面法優化蟲草素水浴提取條件,并用高效液相色譜法測定共生體中蟲草素含量,比較不同光照時長對雜糧蛹蟲草菌絲共生體中蟲草素含量的影響,為雜糧蛹蟲草菌絲共生體的培養條件優化和其綜合利用提供依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

雜糧蛹蟲草菌絲共生體樣品10份:各樣品是蛹蟲草CM-3菌種以雜糧為固體培養基經轉色后分別培養1、3、5、7、9、11、19、27、35、43 d條件下得到的雜糧蛹蟲草菌絲共生體。樣品烘干后,使用高速萬能粉碎機粉碎,過80目篩備用。

蟲草素標準品(HPLC≥98%)上海源葉生物科技有限公司;甲醇(色譜純)天津四友精細化學品有限公司;乙腈(色譜純)天津四友精細化學品有限公司;異丙醇(分析純)天津市富宇精細化工有限公司。

Waters e2695高效液相色譜儀配Waters 2489紫外檢測器及Empower 3數據處理系統Waters公司;HH-42型數顯恒溫攪拌水箱常州國華電器有限公司;TD24-WS型臺式低速離心機湖南湘儀實驗儀器開發有限公司;AL204電子天平上海梅特勒-托利多儀器有限公司;MILLI-Q超純水系統美國Millipore公司。

1.2實驗方法

1.2.1液相色譜條件色譜柱:C18柱,ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動相:V(甲醇)∶V(水)=15∶85;流速:1.0 mL/min,波長:259 nm;進樣量:10 μL;柱溫:30℃;

1.2.2標準曲線準確稱取蟲草素標準品1 mg(精確至0.0001 g),用水溶解后定容至10 mL,搖勻,配置成蟲草素標準品母液(100 μg/mL)。分別準確吸取0.1、0.2、0.5、1.0、2、5 mL母液于10 mL容量瓶中,加水定容搖勻,配制成濃度分別為1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg/mL的標準溶液。根據色譜條件進行測定,以蟲草素濃度為橫坐標,相應的峰面積為縱坐標,計算得出標準曲線和線性回歸方程。

1.2.3雜糧蛹蟲草菌絲共生體樣品處理準確稱取樣品0.1 g(精確至0.0001 g)于10 mL離心管中,加入一定料液比的超純水,至于一定溫度下的恒溫水浴箱中提取一定時間。取出離心(4000 r/min,10 min)后,將上清液定容至10 mL,取1.5 mL過0.45 μm微孔濾膜,供上機分析。

1.3響應面優化水浴提取蟲草素的實驗設計

1.3.1單因素實驗本實驗主要考察水浴提取方法中的浸提時間、浸提溫度和料液比對雜糧蛹蟲草菌絲共生體中蟲草素含量的影響。

浸提時間:固定浸提溫度為60℃,料液比為1∶15,浸提時間選擇2、4、6、8、10 h五個水平,按照1.2.3進行實驗,記錄各水平的峰面積。

浸提溫度:固定浸提時間為6 h,料液比為1∶50,浸提溫度分別選擇50、60、70、80、90℃五個水平,按照1.2.3進行實驗,記錄各水平的峰面積。

料液比:固定浸提溫度為60℃,浸提時間為6 h,料液比選擇1∶10、1∶30、1∶50、1∶70、1∶90五個水平,按照1.2.3進行實驗,記錄各水平的峰面積。

1.3.2響應曲面法實驗使用Design-Expert8.0軟件,根據單因素實驗結果結合Box-Behnken實驗設計得出不同的蟲草素提取條件,按照1.2.3所述方法進行實驗。將實驗數據進行統計學分析后,得出蟲草素對于浸提時間、浸提溫度和料液比的回歸模型及最優提取條件,并進行驗證。Box-Behnken實驗因素水平和編碼見表1所列。

表1　Box-Behnken實驗各變量的編碼水平

1.4方法學考察

精密度實驗:選取任一樣品,在選定色譜條件下連續進樣測定6次,測其峰面積計算RSD。

加標回收率實驗:選取6個樣品,按樣品處理方法進行處理,再加入蟲草素標準品50 μg,后上機測定,計算加標回收率。

日內穩定性實驗:選取任一樣品分別于0、2、4、8、12、24 h時進樣分析,測其峰面積計算RSD。

日間穩定性實驗:選取任一樣品分別于1、2、3、4、6、8 d時進樣分析,測其峰面積計算RSD。

1.5統計分析

運用Microsoft Excel、SPSS 17.0軟件和Design Expert 8.0軟件對實驗數據進行統計學分析,檢驗水準α=0.05。

圖1　蟲草素含量標準曲線Fig.1　Standard curve of cordycepin注:從低到高依次為濃度是1、2、5、10、20、 50、100 μg/mL的蟲草素標準品的色譜圖。

2　結果與分析

2.1蟲草素標準曲線和線性范圍考察

蟲草素標準曲線如圖1,得到回歸方程:y=16799.5169x-4683.3499,其中x為蟲草素濃度(μg/mL),y為峰面積(106),R2=0.9996,結果表明,蟲草素標準溶液在0～100 μg/mL范圍內,濃度與峰面積線性關系良好。蟲草素標準品高效液相色譜圖見圖2。

圖2　蟲草素標準品HPLC重疊色譜圖Fig.2　HPLC overlapping chromatogram of cordycepin standard

2.2單因素實驗結果

2.2.1浸提時間對蟲草素含量的影響結果如圖3所示,在其他條件一定時,浸提時間4～6 h對蟲草素含量影響很大,呈明顯增加趨勢;當達到6 h時,含量達到最大值;再隨著浸提時間的延長,6～8 h期間蟲草素含量又顯著減少,后趨于平穩。分析原因可能是在一定時間范圍內,隨著浸提時間的延長有利于蟲草素的溶出,但過長又會引起其降解,使得含量下降,因此選擇浸提時間6 h。

圖3　浸提時間對蟲草素含量的影響Fig.3　Effect of extraction time on the content of cordycepin

2.2.2浸提溫度對蟲草素含量的影響結果如圖4所示,在其他條件一定時,隨著浸提溫度的增大,蟲草素含量呈現上升趨勢后趨于平穩,在80℃時有一個小高峰。溫度過低時,蟲草素溶解不充分,而高溫可使傳質速度提高以此來增加蟲草素的溶解度,因此選擇浸提溫度80℃。

圖4　浸提溫度對蟲草素含量的影響Fig.4　Effect of extraction temperature on the content of cordycepin

2.2.3料液比對蟲草素含量的影響結果如圖5所示,在其他條件一定時,料液比1∶10～1∶30對蟲草素含量影響很大,蟲草素含量顯著增加;隨著料液比由1∶30增加到1∶70,蟲草素含量略有增加,但變化不明顯,在1∶70時達到最大值;后隨著料液比的增加,又略有下降。料液比過小,容易使得蟲草素的提取不完全,造成浪費,所以選擇料液比1∶70。

圖5　料液比對蟲草素含量的影響Fig.5　Effect of solid-liquid ratio on the content of cordycepin

2.3Box-Behnken實驗優化蟲草素提取結果

根據單因素實驗結果,使用Design-Expert8.0軟件,以蟲草素含量為響應值,自變量包括浸提時間、浸提溫度和料液比,進行3因素3水平Box-Behnken實驗。對各個變量的水平進行編碼,結果見表1,響應面實驗設計及結果見表2。

表2　Box-Behnken實驗設計及響應值

利用Design-Expert8.0軟件對以上數據進行擬合回歸分析,得出蟲草素對編碼后的自變量浸提時間、浸提溫度和料液比的二次多項回歸方程:

蟲草素含量=6.05+0.11A-5.408×10-3B+0.093C+7.898×10-4AB-0.014AC+0.028BC-0.16A2-0.061B2-0.020C2

表3　回歸模型方差分析

回歸模型中各因素的系數能直觀的顯示各因素對蟲草素得率的影響程度,其F值的大小與該因素對響應值的影響呈正相關。由表3可知,浸提時間和料液比對蟲草素含量具有高度顯著影響,而浸提溫度對其影響不顯著(p>0.05)。三個因素間兩兩交互作用的響應曲面和等高線圖如圖6所示:浸提時間與浸提溫度對蟲草素含量影響的交互作用相對較弱,等高線圖趨于圓形;浸提時間與料液比對蟲草素含量影響的交互作用相對較強,其中浸提時間變化比料液比變化對蟲草素含量的影響大,其等高線更密集;浸提溫度與料液比對蟲草素含量影響的交互作用在三組兩兩交互作用中是最強的。

2.4最優提取條件驗證

根據響應曲面法得出的最優提取條件為:浸提時間6.59 h、浸提溫度81.9℃、料液比1∶90,在此條件下預測蟲草素含量為6.1445mg/g。按照最優條件提取同一樣品中的蟲草素,平行測定3次,得到平均蟲草素含量為6.0143mg/g,與預測值相差2.12%,證明優化的提取條件有較高的可信度。

2.5方法學考察

2.5.1精密度實驗選取任一樣品,在選定色譜條件下連續進樣測定6次,測其峰面積計算RSD,結果見表4。

表4　精密度實驗

由表4可知,連續進樣6次,蟲草素的RSD值為0.82%,小于2%,且色譜峰保留時間波動在0.01～0.06 min,說明該實驗方法精密度良好。

2.5.2加標回收率實驗選取6個樣品,按樣品處理方法進行處理,再加入蟲草素標準品50 μg,后上機測定,計算加標回收率。

由表5可知,蟲草素的加標回收率在101.96%～104.76%之間,RSD值為1.16%,說明該實驗方法加標回收效果較好,可用于蟲草素含量的測定。

表5　加標回收率實驗

2.5.3日內穩定性實驗選取任一樣品分別于0、2、4、8、12、24 h時進樣分析,測其峰面積計算RSD。

2.5.4日間穩定性實驗選取任一樣品分別于1、2、3、4、6、8 d時進樣分析,測其峰面積計算RSD。

穩定性實驗結果如表6和表7所示,在不同的時間進樣同一樣品,蟲草素含量保持相對穩定,其RSD值分別為1.04%和1.79%,穩定性良好。

表6　日內穩定性實驗

表7　日間穩定性實驗

2.6不同光照時長對雜糧蛹蟲草菌絲共生體中蟲草素含量的影響

根據不同光照培養時間將蛹蟲草菌絲共生體的生長過程劃分為4個生長期:轉色期(1～5 d)、原基形成期(5～9 d)、現蕾期(9～27 d)、子實體旺長期(35～43 d)。本實驗以響應面優化后的最優提取條件為基礎,對樣品測得的蟲草素含量見表8。

由表8可知,在實驗范圍內,不同光照時長之間,雜糧蛹蟲草菌絲共生體中蟲草素的含量差異均有統計學意義(p=0.000)。且在雜糧蛹蟲草菌絲共生體生長的4個階段,其不同階段間的蟲草素含量差異也具有統計學意義(F=88.880,p=0.000)。隨著光照培養時間的延長,蟲草素的含量總體上呈現先上升后下降的趨勢,在19 d時含量達到最大11.9626mg/g,隨后又逐漸下降并趨于穩定。實驗結果表明,雜糧蛹蟲草菌絲共生體中蟲草素的合成和積累主要在原基形成和現蕾期,這一結果與韋會平[9]報道的現蕾期是收獲蟲草素的最佳時期結果相同。在現蕾期之后,雜糧蛹蟲草菌絲共生體中的蟲草素含量有所下降,可能是因為子實體的旺盛生長使得共生體中蟲草素不斷轉移到子實體中。

表8　光照時長對雜糧蛹蟲草菌絲共生體中蟲草素含量的影響

注:方差分析方法為SNK法;不同的英文字母表示組間在p<0.05水平上差異有統計學意義。

3　結論與討論

本研究通過測定不同光照時長條件下雜糧蛹蟲草菌絲共生體中蟲草素的含量,為共生體的培養條件優化和其綜合利用提供了依據。首先對雜糧蛹蟲草菌絲共生體中蟲草素的水浴提取進行了響應面優化,得到最優提取條件是:浸提時間6.59 h、浸提溫度81.9℃、料液比1∶90,與李琴[10]等研究結果較為接近。在此條件下測得樣品中的蟲草素含量為3.8988～11.9629mg/g,并經統計學分析發現,不同光照時長對蟲草素含量的影響差異顯著。

本文采用的雜糧蛹蟲草菌絲共生體樣品為本實驗室人工培養,蟲草素含量的差異與環境條件和培養條件的差異有關。翁梁[11]等研究不同配方培養基中蟲草素含量在蠶蛹與玉米糝質量比7∶3條件下最高,為4.75mg/g,并且得到在培養基中適量添加黃豆、玉米糝、蛋白胨更有利于蟲草素、多糖、蟲草酸含量提高的結論。顧冬艷[12]等優化北蟲草固態發酵培養基得出大豆粉與麥麩質量比4∶1、料液比39∶30及營養液中添加葡萄糖、牛肉膏、硫酸錳,此條件下蟲草素含量達到5499.12 μg/g。溫魯[13]等研究提高固體培養蛹蟲草核苷類代謝物的產物,從蛹蟲草菌株、培養基碳源、氮源水平、加水量、培養時間和光照等方面進行研究,在以20%豆粉為氮源、按1∶1加營養液、接種CM-2菌株、遮光培養35 d的條件下培養物的蟲草素含量可達5.49mg/g,高于蛹蟲草全草2.83mg/g。樂昕[14]等研究不同蛹蟲草固體栽培基質(大米、小米、高粱米、玉米、小麥)對蟲草素含量的影響發現,高粱米作為培養基質獲得的蟲草素含量較高,達到248.2 mg/100 g,而用小米培養得到的含量最低。基于以上文獻比較發現可知,通過不同固體栽培基質培養蛹蟲草得到子實體中的蟲草素含量在5mg/g左右,而本實驗所采用的雜糧蛹蟲草菌絲共生體中蟲草素的含量明顯較高,特別是在合適的光照時長條件下蟲草素含量能達到11.96mg/g。陸艷艷[15]等測定了人工蟲草子實體、菌絲體和固體培養殘基中蟲草素的含量分別為1356.92、1101.04、350.96 μg/g,其中菌絲體和培養殘基中的蟲草素含量之和高于子實體,這也間接的說明了本實驗室培養的雜糧蛹蟲草菌絲共生體是很有價值的。

目前,蟲草的人工栽培以收獲子實體為主,而大量的培養殘基被直接丟掉,造成浪費和環境污染。而本實驗室以雜糧為固體培養基,接種蛹蟲草后,把菌絲體和雜糧培養基作為一個整體開發利用,以期作為具有一定功效成分的膳食替代。光照時長是影響蟲草生長的一個重要因素,本研究初步探討了光照時長對蟲草素含量的影響,為優化培養條件提供了一定依據。本實驗室還將在本文的研究基礎上,將其他功效成分納入參考,作為下一步工藝條件優化的參考指標。

[1]Ma L,Zhang S,Du M.Cordycepin from Cordyceps militaris prevents hyperglycemia in alloxan-induced diabetic mice[J].Nutr Res,2015,35(5):431-439.

[2]Ren Z,Cui J,Huo Z,et al.Cordycepin suppresses tnf-alpha-induced nf-kappab activation by reducing p65 transcriptional activity,inhibiting ikappabalpha phosphorylation,and blocking ikkgamma ubiquitination[J].Int Immunopharmacol,2012,14(4):698-703.

[3]Nakamura K,Shinozuka K,Yoshikawa N.Anticancer and antimetastatic effects of cordycepin,an active component of Cordyceps sinensis[J].J Pharmacol Sci,2015,127(1):53-56.

[4]Nakamura K,Yoshikawa N,Yamaguchi Y,et al.Antitumor effect of cordycepin(3′-deoxyadenosine)on mouse melanoma and lung carcinoma cells involves adenosine A3 receptor stimulation[J].Anticancer Res,2006,26(1A):43-47.

[5]Zhou X,Luo L,Dressel W,et al.Cordycepin is an immunoregulatory active ingredient of Cordyceps sinensis[J].Am J Chin Med,2008,36(5):967-980.

[6]紀曉朋,杜雙田,房海珍,等.光照度對蛹蟲草生長發育的影響[J].西北農業學報,2014(11):173-179.

[7]杜軍國.蛹蟲草生長發育條件研究[D].西安：陜西科技大學,2013.

[8]簡利茹.光條件對人工培養蛹蟲草子座產量及蟲草素和腺苷的影響[J].西北農業學報,2015,24(4):163-167.

[9]韋會平,葉小莉,張華英,等.用蛹蟲草固體發酵法高效生產蟲草素的研究[J].中國中藥雜志,2008(19):2159-2162.

[10]李琴,廖紅華,張馳.高效液相色譜法測定3種蛹蟲草中蟲草素及比較分析[J].食品科學,2014(14):118-122.

[11]翁梁,溫魯.不同配方下固體培養蛹蟲草活性成分含量比較[J].江蘇農業科學,2014(11):351-353.

[12]顧冬艷,尹永祺,楊潤強,等.北蟲草固態發酵產蟲草素培養基優化[J].食品科學,2013(21):254-258.

[13]溫魯,夏敏,宋虎衛,等.液體培養蛹蟲草蟲草素和腺苷的代謝量[J].微生物學通報,2005(03):91-94.

[14]樂昕,袁蜜,支月娥,等.栽培基質及碳源對蛹蟲草子實體中主要有效成分的影響[J].食品科技,2014(02):2-7.

[15]陸艷艷,邱細敏,蔣誠,等.人工冬蟲夏草不同部位核苷類成分分析[J].食品科技,2011(04):250-252.

Optimizing extraction and determination of cordycepin in multigrain cordyceps militaris hyphae symbionts

CHANG Zheng-jiao,HAN Ping*,LIU Li-e,XU Yan-li,JIANG Yong-hong,WANG Wen-ning

(College of Public Health,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,China)

Object:To explore the optimal extraction conditions of cordycepin in multigrain cordyceps militaris hyphae symbionts,the effect of varied lighting duration on cordycepin was compared,the purpose was to provide a basis for the optimization of its technological conditions and comprehensive utilization.Methods:The conditions of waterbath extraction of cordycepin were determined by single factor experiments combined with response surface methodology,the content of cordycepin was determined by high performance liquid chromatography,SPSS 17.0 software was applied for statistical analysis.Results:The results showed that the optimal extraction conditions were:extraction time 6.59 h,extraction temperature 81.9℃,solid-liquid ratio 1∶90.The contents of cordycepin were 6.0143mg/g under this condition.The contents of cordycepin were 3.8988～11.9629mg/g in different lighting duration and were significantly different(p=0.000).Conclusions:The optimal conditions of waterbath extraction of cordycepin were determined and the contents of cordycepin were significantly different under varied lighting duration,which can provide the reference basis for further optimization of culture conditions of multigrain cordyceps militaris hyphae symbionts.

multigrain cordyceps militaris hyphae symbionts;cordycepin;response surface methodology(RSM);high performance liquid chromatography(HPLC);lighting duration

2015-08-07

常正姣(1988-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：營養與疾病，E-mail：bluesysbb@live.cn。

韓萍(1960-)，男，博士，教授，研究方向：營養與疾病，E-mail：hp999@zzu.edu.cn。

TS201.4

A

1002-0306(2016)07-0237-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.07.037