大孔樹脂純化新疆圓柏總黃酮工藝研究

李　倩,奧斯曼江·麥提圖爾蓀,李晨陽,徐　芳,趙　軍,*

(1.新疆大學生命科學與技術學院,新疆烏魯木齊 830046;2.新疆醫科大學公共衛生學院,新疆烏魯木齊 830011；3.新疆藥物研究所維吾爾藥重點實驗室,新疆烏魯木齊 830004)

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大孔樹脂純化新疆圓柏總黃酮工藝研究

李倩1,奧斯曼江·麥提圖爾蓀2,李晨陽3,徐芳3,趙軍3,*

(1.新疆大學生命科學與技術學院,新疆烏魯木齊 830046;2.新疆醫科大學公共衛生學院,新疆烏魯木齊 830011；3.新疆藥物研究所維吾爾藥重點實驗室,新疆烏魯木齊 830004)

通過比較D101、AB-8、HPD400、HPD500、HPD417、HPD826六種大孔樹脂的靜態吸附效果,從中篩選出適合分離新疆圓柏總黃酮的樹脂,并在單因素實驗基礎上正交優化最佳大孔樹脂對新疆圓柏總黃酮的純化工藝。結果表明,D101大孔樹脂對新疆圓柏總黃酮具有較好的分離效果;最佳純化工藝條件為,上樣濃度1.2256 mg/mL,上樣流速1.0 mL/min,除雜用水量5 BV,乙醇濃度50%,洗脫劑用量4 BV,洗脫流速1.0 mL/min。在此條件下獲得總黃酮回收率為88.36%,純度為69.96%。

新疆圓柏,總黃酮,大孔樹脂,純化

新疆圓柏(Juniperus sabina L.)為柏科圓柏屬植物,又稱叉子圓柏、爬柏、臭柏、沙地柏等,廣泛分布于我國新疆、甘肅、內蒙古和陜北的干旱荒山和沙地之中[1]。該植物的藥用部位為嫩枝葉和果實,味微辛辣而稍苦,氣辛香,在維吾爾醫臨床中用于風寒頭痛、風濕性關節炎等疑難病癥的治療[2]。圓柏屬植物含有雙黃酮、木脂素、二萜和倍半萜等多種類型的化合物,黃酮類化合物是其主要的標示性成分[3-5]。近年來已有關于新疆圓柏總黃酮的提取研究[6-7],但對大孔樹脂純化新建圓柏總黃酮的研究未見報道。大孔樹脂是一類不溶于酸、堿各種有機溶劑,具有較好吸附性的有機高分子聚合物[8],廣泛用于黃酮、多酚等活性物質的分離純化[9-10]。本文在前期研究基礎上,系統地研究了新疆圓柏總黃酮在大孔樹脂上的吸附和解吸附規律,確定了新疆圓柏總黃酮的大孔樹脂最佳純化工藝,為其富集純化和工業化生產提供依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

新疆圓柏2014年9月采自新疆烏魯木齊南山,由新疆藥物研究所何江副研究員鑒定為新疆圓柏Juniperus sabina L.的枝葉,儲存于新疆藥物研究所標本室。將新疆圓柏枝葉脫脂干燥后粉碎,過50目篩,裝于樣品袋中備用。

蘆丁對照品中國藥品生物制品鑒定所(批號10080-200707);大孔吸附樹脂(D101、AB-8、HPD400、HPD500、HPD417、HPD826)天津興南允能高分子技術有限公司;柱層層析硅膠青島海洋化工廠分廠;其它試劑均為國產分析純。

AL204電子天平梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;752型紫外分光光度計上海科宇實驗儀器廠;N-1100旋轉蒸發儀上海愛朗儀器有限公司;DZTW型調溫電熱套北京市永光明醫療儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1樣品溶液的制備取新疆圓柏枝葉樣品100 g,以料液比1∶25(g/mL)加入50%乙醇,回流提取3次,每次提取1.5 h,過濾,合并濾液,減壓濃縮至膏狀。然后以適量硅膠拌樣后上硅膠柱,分別用石油醚、石油醚-乙酸乙酯(1∶1)、石油醚-乙酸乙酯(2∶8)、60%乙醇洗脫。收集60%乙醇洗脫液,減壓濃縮至無乙醇味后,再用蒸餾水溶解制成樣品溶液,待用。

1.2.2標準曲線的繪制準確稱取干燥恒重的蘆丁標準品0.0100 g,甲醇溶解并定容于50 mL容量瓶中,搖勻,制得蘆丁對照品濃度為0.200 mg/mL。精確量取1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL蘆丁對照品溶液分別置于25 mL容量瓶中,分別加入5% NaNO21.0 mL,搖勻,放置6 min后加入10% Al(NO3)31.0 mL,搖勻,放置6 min后加入4%NaOH 10.0 mL,用去離子水定容25 mL,放置10 min后,以相應試劑為空白,于509 nm波長處測定吸光度。以蘆丁質量濃度(C,mg/mL)為橫坐標,吸光度(A)為縱坐標,繪制蘆丁標準曲線。

1.2.3大孔吸附樹脂型號的篩選稱取經預處理的不同型號大孔樹脂2.0 g,置于100 mL磨口三角瓶中,加入樣品溶液(總黃酮含量為0.8614 mg/mL)30 mL,每隔10 min振搖1 min,持續2 h,然后靜置22 h。充分吸附后,測定吸附前后溶液中黃酮的含量,計算吸附量和吸附率。進一步用去離子水洗去殘留的黃酮,吸干水分后加入30 mL 70%乙醇,每隔10 min振搖1 min,持續2 h,然后靜置22 h。充分解吸后,測定解吸液中新疆圓柏總黃酮的含量,計算解吸率。

式中:C0:吸附前總黃酮濃度,mg/mL;C1:吸附后總黃酮濃度,mg/mL;C2:解吸液中總黃酮濃度,mg/mL;V1:樣液體積,mL;V2:解吸液體積,mL;m:樹脂的質量,g。

1.2.4大孔吸附樹脂的靜態吸附動力學特性測定稱取經預處理的D101樹脂10 g,置于500 mL具塞磨口錐形瓶中,加入0.8614 mg/mL樣品溶液150 mL,在室溫下振搖,按時間點(1、2、3、4、6、8、10、12、24 h)吸取上清液測定總黃酮濃度。以時間為橫坐標,吸附率為縱坐標,繪制靜態吸附動力學曲線。

1.2.5大孔樹脂動態吸附與解吸工藝研究

1.2.5.1上樣濃度對吸附量的影響量取D101樹脂15 mL,濕法裝柱,分別加入濃度為0.6128 mg/mL(160 mL)、1.2256 mg/mL(80 mL)、2.4512 mg/mL(40 mL)、4.9023 mg/mL(20 mL)、9.8046 mg/mL(10 mL)的樣品溶液,上樣流速2.0 mL/min。上樣完成后,用水洗至流出液無色,合并流出液,測定總黃酮濃度,計算吸附量。

1.2.5.2上樣流速對吸附量的影響量取D101樹脂15 mL,濕法裝柱,加入2.4512 mg/mL樣液40 mL,調節上樣流速分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL/min。上樣完成后,用水洗至流出液無色,合并流出液,測定總黃酮的濃度,計算吸附量。

1.2.5.3最大上樣量的確定量取D101樹脂15 mL,濕法裝柱,加入2.4512 mg/mL樣液,上樣流速2.0 mL/min;每一個柱體積收集一個流份,測定每一個柱體積中總黃酮的濃度,繪制泄露曲線。

1.2.5.4除雜用水量的確定量取D101樹脂15 mL,濕法裝柱,以上樣流速2.0 mL/min加入濃度為2.4512 mg/mL樣液75 mL。上樣完成后,用水洗脫,每一個柱體積收集一個流份,將每一個流份濃縮干燥至恒重。

1.2.5.5洗脫劑的選擇量取D101樹脂15 mL,濕法裝柱,以上樣流速2.0 mL/min加入濃度為2.4512 mg/mL的樣液75 mL。上樣完成后,用75 mL水洗,再分別用30%、50%、70%、95%乙醇溶液75 mL以2 mL/min的流速洗脫,收集洗脫液,定容至100 mL,測定總黃酮的含量,計算回收率。然后旋蒸濃縮,干燥,計算純度。

回收率(%)=(洗脫液總黃酮量/上柱總黃酮量)×100

1.2.5.6洗脫劑用量的確定量取D101樹脂15 mL,濕法裝柱,以上樣流速2.0 mL/min加入濃度為2.4512 mg/mL的樣液75 mL。上樣完成后,先用75 mL水洗,再用50%乙醇溶液以2 mL/min的流速洗脫,每一個柱體積收集一個流份,測定每一個柱體積中總黃酮的濃度。以柱體積為橫坐標,每一個柱體積中黃酮濃度為縱坐標,繪制洗脫曲線,確定洗脫劑的用量。

1.2.5.7洗脫流速的考察量取D101樹脂15 mL,濕法裝柱,以上樣流速2.0 mL/min加入濃度為2.4512 mg/mL的樣液75 mL。上樣完成后,用75 mL水洗,再用50%乙醇溶液60 mL分別以1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL/min的流速洗脫,收集洗脫液,定容至100 mL,測定總黃酮的含量,計算回收率。

1.2.6新疆圓柏總黃酮純化工藝正交實驗根據單因素實驗結果進行正交實驗。量取D101樹脂15 mL,濕法裝柱(徑高比為1∶4),上樣量為183.5997 mg,用75 mL水除雜,50%乙醇溶洗脫,剩下的條件按正交實驗設計進行,收集洗脫液,定容至100 mL,測定總黃酮的含量,計算回收率。

表1　正交實驗因素水平表

1.3數據統計分析

實驗數據均為3次平行實驗的平均值,用正交設計助手Ⅱv3.1軟件進行正交結果分析,采用OriginPro 8.5.0軟件作圖。

2　結果與分析

2.1標準曲線方程

按照1.2.2中所述方法繪制標準曲線,得到標準曲線方程:A=11.249C+0.0044(R2=0.9998),表明對照品溶液質量濃度在0.2～1.8 mg/mL范圍內與吸光度線性關系良好。

2.2大孔吸附樹脂型號的篩選

一般而言,樹脂的吸附效果與樹脂極性、孔徑、比表面積有關[11]。由表2顯示,比表面積大的D101、AB-8、HPD400、HPD500、HPD826的吸附率都比較高,而在這幾種樹脂中,弱極性的D101、AB-8的解吸率較高,其中D101和HPD826吸附和解吸效果較優。而D101樹脂在醫藥食品研發領域應用非常普遍,對該樹脂本身質量(如溶劑殘留等)的研究較多。因此綜合考慮,選擇D101樹脂作為新疆圓柏總黃酮富集純化的最佳樹脂型號。

表2　六種樹脂靜態吸附及解吸結果

2.3大孔吸附樹脂的靜態吸附動力學特性測定

由圖1可知,D101樹脂的吸附率隨時間的延長逐漸增加。當吸附時間達到8 h以后,樹脂對黃酮的吸附率增長十分緩慢,吸附基本達到平衡。因此,D101樹脂對新疆圓柏總黃酮的吸附時間為8 h。

圖1　樹脂靜態吸附動力學曲線Fig.1　Kinetic curves of the static adsorption of resin

2.4動態吸附與解吸工藝研究

2.4.1上樣濃度對吸附量的影響由圖2可知,當上樣量一定時,上樣濃度對樹脂吸附量有較大的影響。隨著上樣濃度的增加,溶質的溶解性越差,樹脂吸附量逐漸降低,當上樣濃度大于2.4512 mg/mL時,吸附量明顯下降。而上樣濃度過低,要使樹脂達到相同的吸附量,則會耗時越長,影響效率。因此,選擇最適的上樣濃度為2.4512 mg/mL。

圖2　上樣濃度對吸附量的影響Fig.2　Effect of sample concentration on adsorption capacity

2.4.2上樣流速對吸附量的影響由圖3可知,吸附量隨上樣流速的增大而下降。當上樣流速在1.0～2.0 mL/min時下降趨勢小,當上樣流速達到3.0 mL/min以后下降趨勢明顯。一般而言,上柱液通過樹脂柱越慢,越能與樹脂充分接觸,從而黃酮能更好地被樹脂吸附;若上樣流速太快,吸附量會隨著流速的增加而降低[12]。綜合工作效率和吸附效果考慮,選擇上樣流速為2.0 mL/min。

圖3　上樣流速對吸附量的影響Fig.3　Effect of sample flow rate on adsorption capacity

2.4.3最大上樣量的確定由圖4可知,從上樣開始就有少量黃酮的泄露。在達到5 BV后出現明顯泄露。隨著上樣量的增加,泄露的黃酮越多,當達到17 BV后泄露曲線變緩,說明樹脂已基本達到飽和。為了避免造成總黃酮的浪費,選取最大上樣體積為5 BV。

圖4　D101樹脂對總黃酮的吸附泄露曲線Fig.4　Leak curve of total flavonoids about D101 resin

2.4.4除雜用水量的確定由圖5可知,隨著除雜用水量的增加,雜質的質量逐漸減少。當除雜用水量達到5 BV后,雜質的質量很小且幾乎不再發生變化,說明大部分的雜質已經被洗脫下來了。因此,選取5 BV的水除雜。

圖5　除雜用水量的確定Fig.5　Effect of water consumption on removing impurity

2.4.5洗脫劑濃度的選擇由圖6可知,50%、70%、95%乙醇洗脫的回收率較高,而得到的總黃酮純度隨乙醇濃度的增加而降低。這可能是因為乙醇濃度越高,洗脫下來的物質越多,總黃酮的純度也就越低。綜合回收率和純度考慮,選取50%乙醇作為洗脫溶劑。

圖6　乙醇濃度對總黃酮回收率和純度的影響Fig.6　Effect of ethanol concentration on recovery rate and purity

2.4.6洗脫劑用量的確定由圖7可知,第1、2 BV已經洗脫下來大部分的黃酮,到第4 BV幾乎全部被洗脫下來,之后的洗脫液中黃酮含量甚微。因此,選擇4 BV的50%乙醇洗脫。

圖7　黃酮動態洗脫曲線Fig.7　The dynamic desorption curve of flavonoids

2.4.7洗脫流速的考察由圖8可知,總黃酮回收率隨洗脫流速的增加而減少。當洗脫流速達到3.0 mL/min以后,總黃酮回收率緩慢減少。綜合總黃酮回收率和工作效率的考慮,選取2.0 mL/min為洗脫流速。

圖8　洗脫流速對總黃酮回收率的影響Fig.8　Effect of desorption rate on recovery rate of total flavonoids

2.5新疆圓柏總黃酮純化工藝正交實驗

由表3可知,4個因素對新疆圓柏總黃酮純化回收率的影響大小依次為上樣濃度>上樣流速>洗脫流速>洗脫劑用量。新疆圓柏總酮純化的最優組合為A1B1C2D1,即上樣濃度1.2256 mg/mL,上樣流速1.0 mL/min,洗脫劑用量4 BV,洗脫流速 1.0 mL/min。由表4可知,上樣流速對新疆圓柏總黃酮純化回收率的影響顯著。根據最優組合條件進一步做驗證實驗,得出新疆圓柏總黃酮純化回收率為88.36%,RSD為1.53%,純度為69.96%,RSD為1.18%,符合正交實驗中得到的結果,且結果重復性好,說明所選條件合理。

表3　正交實驗結果

表4　方差分析表

注:F0.05(2,2)=19.000,*表示在p<0.05水平上差異顯著。

3　結論

本研究結果表明,大孔樹脂D101對新疆圓柏總黃酮的吸附和解吸效果較好,是純化新疆圓柏總黃酮的理想樹脂。D101純化新疆圓柏總黃酮的最佳工藝是上樣濃度1.2256 mg/mL,上樣流速1.0 mL/min,除雜用水量5 BV,乙醇濃度50%,洗脫劑用量4 BV,洗脫流速1.0 mL/min。在此條件下大孔樹脂D101純化新疆圓柏總黃酮,總黃酮回收率為88.36%,純度為69.96%,大孔樹脂純化前黃酮純度提高了2.79倍。與已有研究的聚酰胺純化結果[7]相比,D101大孔樹脂純化的總黃酮純度達到了聚酰胺純化的總黃酮純度(69.54%)。因此,該純化工藝簡便、易行,重復性好,可作為新疆圓柏總黃酮的有效富集方法。

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Purification of total flavonoids from juniperus sabina l. by macroporous resin

LI Qian1,MAITITUERSUN Aosimanjiang2,LI Chen-yang3,XU Fang3,ZHAO Jun3，*

(1.College of Life Sciences&Technology,Xinjiang University,Urumqi 830046,China; 2.College of Public Health,Xinjiang Medical Unicersity,Urumqi 830011,China; 3.Xinjiang Key Laboratory for Uighur Medicines,Xinjiang Institute of Materia Medica,Urumqi 830004,China)

By comparing the static adsorption effect of D101,AB-8,HPD400,HPD500,HPD417 and HPD826 macroporous resin,resin was screened out for separating total flavonoids from Juniperus sabina L.And purification process of total flavonoids from Juniperus sabina L.was optimized by orthogonal exceperiments based on single factor exceperiments.the results showed that D101 macroporous resin for total flavonoids had good separation effect.The optimal parameters for purification were as follows:the sample concentration of 1.2256 mg/mL,the sample flow rate of 1.0 mL/min,water consumption on removing impurity of 5 BV,ethanol concentration of 50%,eluting agent volume of 4 BV,desorption rate of 1.0 mL/min.Under these conditions total flavonoids had a recovery rate of 88.36% and a purity of 69.96%.

Juniperus sabina L.;total flavonoids;macroporous resin;purification

2015-09-17

李倩(1992-),女,碩士研究生,研究方向:藥食兼用植物的研究與開發,E-mail:yaaitingzheng@163.com。

趙軍(1973-),男,博士,研究員,研究方向:中藥與天然藥物化學研究,E-mail:zhaojun21cn@163.com。

國家自然科學基金(81160515)。

TS284.2

B

1002-0306(2016)07-0188-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.07.028