響應面優化紅米原花青素提取工藝

羅舜菁,馬　燁,劉成梅,龔二生,李　倩,曾子聰,張玫美

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047)

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響應面優化紅米原花青素提取工藝

羅舜菁,馬燁,劉成梅*,龔二生,李倩,曾子聰,張玫美

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047)

采用響應面法優化紅米原花青素的提取條件。以產自哈爾濱延壽縣紅香米為原料,在單因素實驗的基礎上,通過響應面實驗,得出紅米原花青素最佳提取條件為:丙酮濃度76%,溫度39℃,料液比1∶25(g/mL),pH5,提取次數2次,時間40 min,原花青素得率是現有文獻報道的紅米原花青素含量最高的傳統斯里蘭卡Sudu Heenati紅米的1.925倍,為(4.37±0.02)mg/g。紅外圖譜分析發現紅米原花青素純化物主要是由(表)兒茶素的結構單元構成的原花青定聚合物。清除DPPH自由基實驗顯示紅米原花青素的抗氧化活性強于VC,表明紅米原花青素有較強的抗氧化活性,可作為原花青素天然植物來源。

紅米,原花青素,提取,純化,抗氧化

紅米(Red Rice)是全谷物中的有色谷物,因其果皮和種皮上沉積色素而顯紅色。有色米因其遠高于淺色米的抗氧化活性,近幾年來已逐漸成為研究熱點[1-3]。現有研究報道表明,紅米是各種谷物中抗氧化活性最強的品種,高于紫米和蕎麥,遠高于淺色糙米、小麥和燕麥等谷物[4],并且表現出比淺色糙米、紫米更強的癌細胞抗增殖活性[5]。但紅米因受其地域和文化限制,僅在一些亞洲國家如中國、斯里蘭卡、印度等,被作為一種傳統糧食長期種植和食用。在西方國家,紅米的種植和消費都十分受限制,人們通常認為紅米是一種野草[6]。我國是有色米產量最大的國家,目前國內保存的有色稻種質資源中,紅米稻種占據首位[7]。但現階段國內外對大米的研究多集中在淺色糙米和黑米上,對紅米的研究不多。

紅米中主要的抗氧化活性物質為原花青素[8]。原花青素有清除自由基、抗癌、保護心血管、美容及抗疲勞等作用,在食品、化妝品、醫藥等領域應用廣泛,是目前國際上公認的清除人體內自由基最有效的天然抗氧化劑,在歐美等國家享有“皮膚維生素”和“口服化妝品”的美譽[9]。原花青素含量豐富的品種主要是水果[10],其中以對葡萄原花青素的研究最多,在一些谷物和豆類也有相關報道,如大麥和扁豆,但在大米品種中少有報道。本實驗探討了溶劑提取法提取紅米原花青素的工藝,采用響應面法優化工藝條件,并優化了紅米原花青素的純化工藝,同時測定純化后紅米原花青素的紅外結構和抗氧化活性,旨在為紅米中原花青素的開發利用提供科學依據,并為發現原花青素的天然植物來源新資源提供更多選擇。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

紅香米,原產地:黑龍江哈爾濱延壽縣中和鎮;甲醇、丙酮、乙醇均為分析純上海化學試劑公司;大孔樹脂(NKA-9,AB-8,S-8,NKA-Ⅱ,X-5,D101)南開大學化工廠;(+)-兒茶素標準品(色譜純)美國Sigma公司;DPPH美國Sigma公司;香草醛、VC上海化學試劑公司。

T6紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限公司飛鴿牌;AK/QC-058離心機上海安亭科學儀器廠;FBC1001超純水機青島富勒姆科技有限公司;RE-52C旋轉蒸發儀上海亞榮生化儀器廠;AR1140型電子天平奧豪斯儀器(上海)有限公司;FW80高速萬能粉碎機天津市泰斯特儀器有限公司;FT/IR-480傅里葉變換紅外光譜儀日本島津公司。

1.2實驗方法

1.2.1紅米原花青素的提取紅米粉碎后過60目篩,40℃干燥使水分含量低于10%,并于-20℃儲存備用。提取方法:準確稱取1.0000 g紅米粉,按一定的料液比用有機溶劑在一定的pH下恒溫磁力攪拌一定時間,4800×g離心10 min,分離上清,殘渣再提一次,合并上清得原花青素提取液,于-20℃儲存備用[11]。

1.2.2原花青素含量的測定采用香草醛-濃鹽酸法測定[12],精確移取0.5 mL樣液置于10 mL試管中,加入2.5 mL 1%香草醛-甲醇溶液和2.5 mL 30%濃鹽酸-甲醇溶液,30℃水浴避光反應20 min,以0.5 mL甲醇代替樣液作為空白對照,于500 nm波長處測定吸光值,記錄實驗數值。實驗重復測定3次。

1.2.3原花青素標準曲線的繪制精確稱取一定質量的(+)-兒茶素標準品,用甲醇溶解并定容于容量瓶中,依次配制1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5 mg/mL濃度的(+)-兒茶素標準溶液。用1.2.2中的方法測定吸光度。以標準品濃度為橫坐標,以吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.4紅米原花青素提取工藝的優化

1.2.4.1單因素實驗設計a.提取溶劑對原花青素提取效果的影響:按1.2.1的方法準確稱取1.0000 g紅米粉,料液比1∶20(g/mL),選用70%的不同溶劑(甲醇、乙醇、丙酮),將pH調至6.5,20℃恒溫磁力攪拌20 min,提取1次,定容后測吸光度。

b.丙酮濃度對原花青素提取效果的影響:按1.2.1的方法準確稱取1.0000 g紅米粉,料液比1∶20(g/mL),選用50%、60%、70%、80%的不同濃度的丙酮,將pH調至6.5,20℃恒溫磁力攪拌20 min,提取1次,定容后測吸光度。

c.料液比對原花青素提取效果的影響:按1.2.1的方法準確稱取1.0000 g紅米粉,料液比1∶10,1∶15，1∶20,1∶25，1∶30(g/mL),加入70%丙酮溶液,將pH調至6.5,20℃恒溫磁力攪拌20 min,提取1次,定容后測吸光度。

d.pH對原花青素提取效果的影響:按1.2.1的方法準確稱取1.0000 g紅米粉,料液比1∶20(g/mL),加入70%丙酮溶液,將pH調至2、3、4、5、6,20℃恒溫磁力攪拌20 min,提取1次,定容后測吸光度。

e.提取次數對原花青素提取效果的影響:按1.2.1的方法準確稱取1.0000 g紅米粉,料液比1∶20(g/mL),加入70%丙酮溶液,將pH調至6.5,20℃恒溫磁力攪拌20 min,重復提取1次、2次、3次,定容后測吸光度。

f.時間對原花青素提取效果的影響:按1.2.1的方法準確稱取1.0000 g紅米粉,料液比1∶20(g/mL),加入70%丙酮溶液,將pH調至5,20℃恒溫磁力攪拌10、20、30、40、50、60 min,重復提取2次,定容后測吸光度。

g.溫度對原花青素提取效果的影響:按1.2.1的方法準確稱取1.0000 g紅米粉,料液比1∶20(g/mL),加入70%丙酮溶液,將pH調至5,20、30、40、50、60℃恒溫磁力攪拌40 min,重復提取2次,定容后測吸光度。

1.2.4.2響應面實驗設計在單因素的基礎上,以A丙酮濃度(%)、B提取溫度(℃)、C料液比(g/mL)三個因素為自變量,以原花青素得率為響應值,根據Box-Behnken 中心組合實驗設計因素水平表,并運用Design-Expert 8.0.5 軟件進行優化分析,以確定最佳提取工藝。三因素三水平表如表1。

表1　Box-Benhnken實驗設計因素和水平

原花青素得率計算公式如下:

原花青素得率(mg/g)=提取液原花青素濃度(mg/mL)×提取液體積(mL)/紅米干基質量(g)

1.2.5原花青素的純化取4.000 g預處理后的D101樹脂,濕法裝柱,對提取后的紅米原花青素進行純化,純化條件為:上樣流速1 mL/min,上樣濃度0.68 mg/mL,上樣量5 BV,水洗體積5 BV,丙酮解析液濃度60%,解析液用量4 BV,將解析后的溶液減壓旋蒸,凍干備用。原花青素的純度按下述公式計算:

原花青素純度(%)=純化液中原花青素的濃度(mg/mL)×純化液體積(mL)/純化物質量(mg)×100

1.2.6紅外測定將純化后的紅米原花青素粉末與溴化鉀按2%比例混合研磨壓片,在紅外光譜儀中先對純溴化鉀薄片進行背景掃描,再對含有樣品的KBr薄片進行掃描,掃描波數為4000～400 cm-1,測定其紅外光譜。

1.2.7抗氧化活性測定參考文獻[13],準確稱取 DPPH 7.9 mg,用95%的乙醇溶解定容于100 mL容量瓶中,作為反應液備用。配制10、20、50、100、250 μg/mL樣品甲醇溶液和10、20、50、100、250 μg/mL VC水溶液,甲醇溶液,分別準確移取1 mL于10 mL試管,再分別加入3 mL DPPH反應液,充分搖勻,在背光處靜置30 min,于517 nm處測定其吸光值,重復3次實驗。DPPH自由基清除率按下述公式計算,并計算出自由基抑制率為50%時的樣品濃度,即為半數抑制率IC50。

式中:Ai為3 mL DPPH溶液+1 mL樣品或VC溶液的吸光度;A0為3 mL DPPH溶液+1 mL甲醇的吸光度。

1.3數據統計分析

實驗數據用平均值±標準差(Mean±SD)表示,spss16.0分析各數據間的差異顯著性,Design-Expert 8.0進行多元回歸擬合和方差分析。

2　結果與討論

2.1原花青素含量的標準曲線

按方法1.2.2制備兒茶素標準溶液并繪制標準曲線如圖1所示,兒茶素當量與吸光度曲線的回歸方程為y=0.4514x-0.0356,R2=0.9991,表明原花青素含量在0.4～1 mg/mL兒茶素當量范圍內線性關系良好。

圖1　兒茶素標準曲線Fig.1　The standard curve of catechin

2.2紅米原花青素提取單因素實驗

2.2.1不同溶劑對原花青素提取效果的影響原花青素的提取溶劑最常用的有甲醇、乙醇和丙酮。由圖2可知,甲醇、乙醇、丙酮均可將原花青素溶出,其中丙酮提取出的原花青素含量最高,甲醇最低,丙酮的羰基氧可作為強的氫鍵受體,能在葡聚糖上將結合的多聚體酚類取代下來[14]。故選擇丙酮為提取溶劑。

圖2　不同溶劑對原花青素提取效果的影響Fig.2　Effect of different extraction agents on the extraction of proanthocyanidins

2.2.2丙酮濃度對原花青素提取效果的影響由圖3可知,隨著丙酮濃度的增大,提取液中原花青素的含量逐漸增大,丙酮濃度為70%時,原花青素提取效果最好,當丙酮濃度大于70%,提取液中原花青素含量反而降低。這可能是因為當丙酮濃度過大時,一些脂溶性雜質被溶出,與原花青素競爭結合丙酮[15]。故選擇70%丙酮提取原花青素。

圖3　丙酮濃度對原花青素提取效果的影響Fig.3　Effect of acetone concentration on the extraction of proanthocyanidins

2.2.3料液比對原花青素提取效果的影響料液比對原花青素提取效果影響如圖4所示。增大料液比可顯著提高提取液中原花青素的含量,這可能是因為增大料液比可以使原花青素與丙酮充分接觸并溶出[16],當料液比超過1∶20(g/mL)時,提取液中原花青素的含量沒有明顯的增大,故選擇料液比為1∶20(g/mL)提取原花青素。

圖4　料液比對原花青素提取效果的影響Fig.4　Effect of liquid-to-material ratio on the extraction of proanthocyanidins

2.2.4pH對原花青素提取效果的影響pH對原花青素提取效果影響如圖5所示。原花青素含羥基,呈弱酸性,酸性條件有利于原花青素的溶出,而弱堿處理可造成原花青素的大量損失[17]。隨著pH的增大,提取液中原花青素的含量逐漸增大,當pH為5時,提取效果最好,故選擇pH5提取原花青素。

圖5　pH對原花青素提取效果的影響Fig.5　Effect of pH on the extraction of proanthocyanidins

2.2.5提取次數對原花青素提取效果的影響提取次數對原花青素提取效果影響如圖6所示。提取2次比提取1次顯著的提高了原花青素提取量,提取2次后再增加提取次數,原花青素提取量沒有明顯的增大,故選擇提取2次。

圖6　提取次數對原花青素提取效果的影響Fig.6　Effect of extraction times on the extraction of proanthocyanidins

2.2.6時間對原花青素提取效果的影響提取時間對原花青素提取效果影響如圖7所示。由圖7可看出,隨著時間的增加,提取出原花青素的含量逐漸增大,這是因為提取時間少,原花青素未被充分溶出,考慮到40 min后增幅不大,故選擇40 min提取原花青素。

圖7　時間對原花青素提取效果的影響Fig.7　Effect of extraction time on the extraction of proanthocyanidins

2.2.7溫度對原花青素提取效果的影響提取溫度對原花青素提取效果影響如圖8所示。隨溫度的升高,提取液中原花青素的含量逐漸增大,當溫度超過40℃時,提取效果反而降低,這可能是因為隨著溫度的升高可加快溶質的擴散和溶劑的滲透,但原花青素的結構不穩定,在溫度過高時,原花青素的結構容易被破壞[18],故選擇40℃提取原花青素。

圖8　溫度對原花青素提取效果的影響Fig.8　Effect of extraction temperature on the extraction of proanthocyanidins

2.3響應面結果分析

在單因素實驗的基礎上,固定提取pH為5,次數為2次,時間為40 min,選擇主要影響因素丙酮濃度(A)、提取溫度(B)、料液比(C)為考察因素,采用Box-Benhnken中心組合設計三因素三水平實驗的三元二次響應面分析方法,優化紅米原花青素提取工藝。因素水平如表1所示。自變量的實驗水平分別以-1、0、1進行編碼,共設計17個實驗點,其中析因點12個,是自變量取值在各因素所構成的三維頂點,中心點5個,用來估計實驗誤差。為了避免人為因素導致的系統誤差,將標準序打亂按照運行序來進行響應面實驗。響應面分析設計見表2。

表2　紅米原花青素得率響應面方案及結果

表3　響應面回歸模型ANOVA分析結果

注:*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001。

利用Design-Expert 8.0 軟件對表2實驗數據進行多元回歸擬合,得到以原花青素得率為響應值的二次多項回歸模型:Y=4.3208+0.1483A-0.0605B+0.1816C+0.00525AB+0.00025BC-0.2349A2-0.2461B2-0.0974C2(其中,Y:原花青素得率;A:丙酮濃度;B:提取溫度;C:料液比)。比較表3的F值可以看出各因素對紅米原花青素提取效果影響為:料液比>丙酮濃度>提取溫度。

以上述優化工藝條件為參考,將實際條件調整為:丙酮濃度76%,溫度39℃,料液比1∶25(g/mL),pH5,提取2次,時間40 min,以檢驗響應面法優化紅米原花青素提取工藝的可靠性。原花青素的得率為(4.37±0.02)mg/g,與模型預測值比較誤差為0.928%,說明該模型能較準確的預測紅米原花青素的提取率,響應面法優化得到的提取工藝科學合理。

不同文獻報道的紅米原花青素含量不同,主要是因為品種和提取方法之間存在差異。Gunaratne[19]研究了八種傳統斯里蘭卡紅米,原花青素含量范圍為1.07～2.27mg/g,其中Sudu Heenati紅米的原花青素含量2.27mg/g,為目前文獻報道的原花青素含量最高的紅米。本實驗所用的紅香米經響應面優化提取后原花青素得率為(4.37±0.02)mg/g,是Sudu Heenati紅米的1.925倍。

2.4紅米原花青素純化后的紅外光譜分析

紅米原花青素經過提取、純化后的純度為(85.37±1.5)%,純度較高,純化效果較好。

圖9　純化后紅米原花青素的紅外圖譜Fig.9　IR Spectra of proanthocyanidin of Red Rice after purification

不同來源的原花青素結構不同,研究原花青素的紅外圖譜可以獲知其基本組成結構單元,其結構分析主要是在1000～1650 cm-1和700～850 cm-1這2個特征骨架振動波數區域。由圖9可知,純化后的紅米原花青素在 3426 cm-1處的單峰是-OH的伸縮振動,1614 cm-1處是C=O的伸縮振動,代表沒食子酸酰基的存在[20],1522、1447 cm-1處的峰是芳香環的結構。原花青素純化物的紅外譜圖在1520～1540 cm-1處有單峰,證明了紅米原花青素是以原花青定為主的聚原花青素。在770～780 cm-1處的單峰773 cm-1,說明含有以(表)兒茶素為主要基礎單元的原花青素中的平面構象,而730 cm-1沒有吸收峰,說明沒有以(表)沒食子兒茶素為主要基礎單元的原花青素中的平面構象[21]。這說明紅米經提取純化后的產物主要是由(表)兒茶素的結構單元構成的原花青定(procyanidin,PC)。

2.5紅米原花青素的抗氧化活性

對不同濃度下紅米原花青素與VC清除DPPH自由基的活性作比較,結果如圖10。從圖中可以看出,紅米原花青素純化液和VC溶液的IC50/DPPH分別為(21.927±1.09)μg/mL和(31.247±0.92)μg/mL,說明在實驗濃度范圍內紅米原花青素清除DPPH自由基能力大于VC。

圖10　紅米原花青素純化液(RRPs)和VC清除DPPH自由基能力Fig.10　DPPH radical scavenging activity of Red Rice Proanthocyanidins and VC

3　結論

采用響應面法優化了紅米原花青素的提取工藝,最佳提取工藝條件為:丙酮濃度76%,溫度39℃,料液比1∶25(g/mL),pH5,提取2次,時間40 min,原花青素得率為(4.37±0.02)mg/g,與預測值4.41mg/g相比誤差為0.928%。優化后原花青素的得率(4.37±0.02)mg/g,是現有文獻報道的紅米原花青素含量最高的Sudu Heenati紅米[19]的1.925倍。

不同來源的原花青素結構不同,通過紅外圖譜分析可知,紅米原花青素主要是由(表)兒茶素的結構單元構成的原花青定聚合物,其具體結構有待進行更深入的研究。

紅米原花青素經過提取純化后清除DPPH自由基能力強于VC,表明紅米原花青素的抗氧化活性較強。

[1]Zhang M W,Guo B J,Zhang R F,et al.Separation,Purification and Identification of Antioxidant Compositions in Black Rice[J].Agricultural Sciences in China,2006,5(6):431-440.

[2]Chung H S,Jin C S.Characterization of antioxidant alkaloids and phenolic acids from anthocyanin-pigmented rice(Oryza sativa cv.Heugjinjubyeo)[J].Food Chemistry,2007,104(4):1670-1677.

[3]Shen Y,Liang J,Peng X,et al.Total phenolics,flavonoids,antioxidant capacity in rice grain and their relations to grain color,size and weight[J].Journal of Cereal Science,2009,49(1):106-111.

[4]Masisi Kabo,Beta Trust,Mohammed H.Moghadasian.Antioxidant properties of diverse cereal grains:A review on in vitro and in vivo studies[J].Food Chemistry,2016,196(1):90-97.

[5]Chen M H,Choi S H,Kozukue N,et al.Growth-inhibitory effects of pigmented rice bran extracts and three red bran fractions against human cancer cells:relationships with composition and antioxidative activities[J].J Agric Food Chem,2012,60(36):9151-9161.

[6]Ahuja U,Ahuja S C,Chaudhary N,et al.Red rices-past,present and future[J].Asian Agri-History,2007,11(4):291-304.

[7]孫明茂,韓龍植,李圭星,等.水稻花色苷含量的遺傳研究進展[J].植物遺傳資源學報,2006,7(2):239-245.

[8]Nam S H,Sun P C,Mi Y K,et al.Antioxidative activities of bran extracts from twenty one pigmented rice cultivars[J].Food Chemistry,2006,94(4):613-620.

[9]Bagchi D,Bagchi M,Stohs S J,et al.Free radicals and grape seed proanthocyanidin extract:important in human health and diseaseprevention[J].Toxicology,2000,148(2/3):187-197.

[10]Ying W,Sang-Jin C,Song W O,et al.Estimation of daily proanthocyanidin intake and major food sources in the U.S diet[J].Journal of Nutrition,2011,141(3):447-452.

[11]Finocchiaro F,Ferrari B,Gianinetti A.A study of biodiversity of flavonoid content in the rice caryopsis evidencing simultaneous accumulation of anthocyanins and proanthocyanidins in a black-grained genotype[J].Journal of Cereal Science,2010,51(1):28-34.

[12]Prior R L,Fan E,Ji H,et al.Multi-laboratory validation of a standard method for quantifying proanthocyanidins in cranberry powders.[J].Journal of the Science of Food & Agriculture,2010,90(9):1473-8.

[13]Zhou H C,Lin Y M,Wei S D,et al.Structural diversity and antioxidant activity of condensed tannins fractionated from mangosteen pericarp[J].Food Chemistry,2011,129(4):1710-1720.

[14]Kantz K,Singleton V L.Isolation and determination of polymeric polyphenos using sephadex LH-20 and analysis of grape tissre extracts[J].Phytochemistry,1990,41(3):223-228.

[15]趙文恩,陳雷,韓雅珊,等.葡萄皮渣原花色素提取分離的初步研究[J].食品科學,2000,21(12):68-69.

[16]張濤,李超,商學兵.葡萄籽原花青素的纖維素酶輔助提取工藝優化[J].中國食品添加劑,2011,5:82-88.

[17]韓澤梅,李曉波,張玉平,等.樹莓種子原花青素的提取分離工藝研究[J].天然產物研究與開發,2006,1:108-111.

[18]趙文杰,敬思群.響應面法回流提取新疆昆侖雪菊原花青素工藝優化[J].食品科技,2013,38(4):214-219.

[19]Gunaratne A,Wu K,Li D,et al.Antioxidant activity and nutritional quality of traditional red-grained rice varieties containing proanthocyanidins[J].Food Chemistry,2013,138(2-3):1153-1161.

[20]Chang S K,Mun S P.Characterization of proanthocyanidin in hot water extract isolated from Pinus radiata bark[J].Wood Science & Technology,2007,41(3):235-247.

[21]Fu C,Yang X,Lai S,et al.Structure,antioxidant andα-amylase inhibitory activities of longan pericarp proanthocyanidins[J].Journal of Functional Foods,2015,14:23-32.

Optimization of extracting proanthocyandins from red rice by response surface methodology

LUO Shun-jing,MA Ye,LIU Cheng-mei*,GONG Er-sheng,LI Qian,ZENG Zi-cong,ZHANG Mei-mei

(State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

Response surface methodology was employed to optimize the extraction conditions of proanthocyanidins from red rice grown in Yanshou,Harbin.Based on single experiments,response surface methodology was employed to optimize the extraction conditions of the red rice,the optimum extractive conditions were ascertained as follows:acetone concentration 76%,extraction temperature 39℃,material-to-liquid ratio 1∶25(g/mL),extraction pH5,extraction twice,extraction time 40 min,the yield of proanthocyanidins of this optimized procedure was(4.37±0.02)mg/g,1.925 times than Sudu Heenati red rice of tradition Sri Lanka which was the highest procyanidins content of red rice reported.The result of infrared spectra showed that the proanthocyanidins of the red rice is mainly composed of structure unit of(epi)-catechin consisting of procyanidin polymers.The proanthocyanidins of red rice have stronger scavenging effects to DPPH radicals than VC,suggesting that the red rice reveals better antioxidant activity,and has the potential to be the source of proanthocyanidins.

red rice;proanthocyandins;extraction;purification;antioxidant activity

2015-09-21

羅舜菁(1969-)，女，碩士，副教授，研究方向：現代高新技術與食品加工工程，E-mail:luoshunjing@aliyun.com。

劉成梅(1963-)，男，博士，研究方向：食品資源利用與開發，E-mail:liuchengmei@aliyun.com。

江西省贛鄱英才555工程領軍人才(18000007)；國家重點實驗室目標導向項目(SKLF-ZZA-201304)。

TS201.2

B

1002-0306(2016)07-0176-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.07.026