基于納豆激酶活性的納豆加工條件的優化研究

劉　野,蘇　杭,宋煥祿,蘇柯冉

(北京工商大學食品學院,北京市食品添加劑工程技術研究中心,北京市食品風味化學重點實驗室,北京 100048)

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基于納豆激酶活性的納豆加工條件的優化研究

劉野,蘇杭,宋煥祿,蘇柯冉

(北京工商大學食品學院,北京市食品添加劑工程技術研究中心,北京市食品風味化學重點實驗室,北京 100048)

為優化納豆加工工藝條件,以納豆激酶活性為指標,采用瓊脂糖—纖維蛋白平板法,通過單因素實驗,確定了納豆的加工工藝參數為:大豆的浸泡時間15 h,121℃高溫蒸煮時間45 min,接種量3%,發酵溫度38℃,發酵時間28 h,后熟時間1 d;用響應面分析法對浸泡時間,蒸煮時間、發酵溫度這三個影響較顯著因素進行優化,最終確定納豆發酵條件:浸泡時間15 h,蒸煮時間51 min,發酵溫度37.5℃。優化后納豆激酶活性達2493.33 U/g。

納豆,納豆激酶,加工條件,優化

納豆有很高的營養價值并具有含量較高的蛋白質、纖維、鈣、鐵、維生素等,在日本被譽為“蔬菜干酪”[1]。1980年后,隨著科技的進步,冷凍技術得到長足的發展,納豆的加工開始由作坊式生產向工業化轉變,并于1983年制定了納豆的日本行業標準,規范納豆的生產[2]。現代化的納豆加工一般步驟是將精選好的大豆,依次通過浸泡、蒸煮、接種納豆菌、發酵、后熟等環節[3]。

納豆作為一種功能性食品,納豆激酶(Nattokinase,NK)是其最具代表性的功效成分。納豆激酶是從發酵大豆中提取的一種生物酶,其特征性作用底物為纖維蛋白。據報道,納豆激酶不僅具有纖溶酶原激活物活性[4],而且還能直接消化利用蛋白質纖維[5]。納豆激酶的體內外溶栓性質通過實驗也已得到確定,在體內作用迅速,持續時間長,還能激活體內的纖維蛋白酶,使之溫和、持續地提高血液的纖溶活性。因此納豆激酶通常作為優化納豆生產工藝的重要指標。李大鵬[6]通過對蔗糖加量、接種量、發酵溫度和發酵時間這4個因素進行考察,確定納豆激酶酶活最高的工藝參數,酶活力為1892 U/g。朱宇剛[7]利用纖維蛋白平板法與Folin-酚法結合測定納豆激酶活性,通過單因素實驗對7個因素進行考察,并通過響應面優化確定了理論酶活性達2797.17 U/g。古亞楠[8]研究對象為豆粕,通過單因素實驗與正交實驗得出固體發酵最適條件:發酵溫度40℃、豆粕140%含水量、10%接種量、發酵時間36 h,產物酶活3203.26 U/g。納豆加工一方面需要考慮到提高其納豆激酶活性,另一方面納豆的風味也是影響其品質的重要因素,因此需要在納豆高酶活性與優良風味間找到平衡點。因此本研究采用納豆的工業化制作工藝制作納豆,并以納豆激酶為指標對加工環節中的浸泡時間、蒸煮時間、接種量、發酵溫度、發酵時間、后熟時間這6個因素進行單因素實驗,再結合感官評價并通過響應面法優化加工工藝參數,以提高納豆激酶的活性。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菌株日本高橋納豆菌素;非轉基因東北一等精品有機黃豆沈陽天地糧人糧油連鎖有限責任公司。

氯化鈉、氫氧化鈉為分析純國藥集團化學試劑有限公司;瓊脂為分析純北京康倍斯科技有限公司;磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉為分析純天津市光復科技發展有限公司;蛋白胨、酵母膏為分析純安琪酵母股份有限公司;瓊脂糖為電泳級西班牙Biowest Agarose公司;尿激酶(1240 U/支)、纖維蛋白原(90 mg/支)、凝血酶(840 U/支)中國食品藥品檢定研究院;甲醛溶液(36%)國藥集團化學試劑有限公司。

JA2003型數字電子天平上海天平儀器廠;YX-280D型滅菌鍋江陰濱江醫療設備有限公司;超凈工作臺上海朗賦實業有限公司;LRH生化培養箱科爾頓有限公司;B2106研磨機普潤;高速冷凍離心機日本Hitachi公司;HH-1數顯電子恒溫水浴鍋金壇市至翔科教儀器廠;HJ-1型磁力攪拌器江蘇國華儀器廠;PHS-3D功能性PH計上海三信儀表廠;電熱鼓風干燥箱上海三信儀表廠;電熱鼓風干燥箱天津中環實驗電爐有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1基本溶液的配制方法

1.2.1.1磷酸緩沖溶液配制參考《果蔬采后生理生化實驗指導》[9]。

1.2.1.2工作溶液配制將0.01 mol/L PBS和0.9%生理鹽水按照1∶17的體積比例配制。

1.2.1.3凝血酶溶液配制將840 U凝血酶溶于0.84 mL超純去離子水中,震蕩混勻,移取100 μL加入到9.9 mL 0.9%生理鹽水中配制成10 U/mL于-20℃條件下保存。

1.2.1.4纖維蛋白原溶液配制準確量取60 mL工作溶液,將90 mg纖維蛋白原移入工作溶液,輕輕震蕩,配制成濃度0.15%的纖維蛋白溶液。使用前,55℃水浴中放置1 min,以便倒進瓊脂糖溶液后,保證瓊脂糖溶液完全處于流動狀態。纖維蛋白溶液較難保存,現用現配,確保實驗精度。

1.2.2納豆激酶(NK)酶活力測定粗酶液的提取:將發酵完成的納豆用研磨機粉碎,按1∶10(w/v)的比例用0.9%無菌生理鹽水于搖床分兩次浸提1 h,合并提取液,8000 r/min離心10 min,上清液即為納豆激酶的粗酶液。

酶活性的測定:本實驗采用了瓊脂糖-纖維蛋白平板法,因其是國家衛生部規定的測定纖溶酶活性的標準方法。首先在培養皿底部鋪一層2%的瓊脂,移取10 U/mL凝血酶0.38 mL置于瓊脂層上,接著將5 mL 1.5%的瓊脂糖溶液小心緩慢地加到5 mL 0.15%纖維蛋白原溶液中混勻,迅速倒入培養皿中,在桌面上靜置,冷卻凝固后,在合適的位置打孔徑為2 mm的均勻小孔。移取10 μL粗酶液點樣于小孔內,37℃培養18 h,卡尺測量溶解圈大小。

納豆激酶的酶活性大小,與粗酶液溶解纖維蛋白產生的透明圈面積呈正相關,粗酶液透明圈的面積與尿激酶標準曲線比對測得納豆激酶酶活性。

1.2.3納豆樣品的制備納豆樣品選擇以市售的顆粒飽滿的東北有機黃豆作為原料,依次經過篩選、浸泡、蒸煮、接種、發酵、后熟過程。

篩選:選取無破損、無霉變、無蟲孔的且大豆粒徑大小基本保持一致。

浸泡:將挑選的大豆清洗干凈,清洗時力道應適當,確保大豆表皮完整,25℃條件下浸泡。

蒸煮:浸泡好的大豆瀝干,均勻鋪展置于高壓滅菌鍋內的平面容器中,確保每粒大豆都直接與外界空氣接觸,121℃高溫蒸煮40 min,也可起到滅菌的效果。

接種:將蒸煮后的大豆冷卻到80℃時在超凈工作臺按2%的比例接入日本高橋納豆菌,攪拌均勻。

發酵培養:接種完畢的大豆放置在發酵網上置于35℃恒溫培養箱中發酵20 h,納豆芽孢桿菌是好氧菌,需確保發酵網內空氣流通。

后熟:發酵好的大豆置于4℃冰箱中后熟24 h,得到成品納豆。

1.2.4單因素實驗方法

1.2.4.1浸泡時間對NK酶活性的影響大豆浸泡時間決定大豆的含水量,影響納豆發酵過程中營養基質的溶解與傳遞。分別稱取5份均為50 g的干大豆加150 mL蒸餾水浸泡,研究浸泡時間分別選取5、10、15、20、25 h,蒸煮30 min,接種量為3%,發酵溫度為38℃,發酵時間為24 h,后熟時間為2 h,測定NK酶活性。

1.2.4.2蒸煮時間對NK酶活性的影響高溫蒸煮過程可以使大豆內蛋白質變性,改變其營養成分的構成方式。實驗分別選取5份100 g浸泡5 h后的大豆,蒸煮時間分別為15、30、45、60、75 min,接種量為3%,發酵溫度為38℃,發酵時間為24 h,后熟時間為2 h,測定NK酶活性。

1.2.4.3接種量對NK酶活性的影響接種量影響到發酵過程中納豆菌的發酵速度。分別稱取5份均為50 g的干大豆加150 mL蒸餾水浸泡5 h,蒸煮30 min,接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%,發酵溫度為38℃,發酵時間為24 h,后熟時間為2 h,測定NK酶活性。

1.2.4.4發酵溫度對NK酶活性的影響微生物都有其生長的最適溫度,溫度影響菌體的生長和發酵過程中的酶促反應速率。分別稱取5份均為50 g的干大豆加150 mL蒸餾水浸泡5 h,蒸煮30 min,接種量為3%,發酵溫度分別為34、36、38、40、42℃,發酵時間為24 h,后熟時間為2 h,測定NK酶活性。

1.2.4.5發酵時間對NK酶活性的影響納豆芽孢桿菌的代謝產酶是一個過程,發酵時間影響納豆菌的代謝程度,同時嚴重影響大豆的風味,分別稱取5份均為50 g的干大豆加150 mL蒸餾水浸泡5 h,蒸煮30 min,接種量為3%,發酵溫度為38℃,發酵時間分別為4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44 h,后熟時間為2 h,測定NK酶活性。同時考慮到發酵時間超過24 h納豆風味會發生較大變化,因此本研究結合感官評價,選取NK酶活性和納豆風味間一個平衡點。

1.2.4.6后熟時間對NK酶活性的影響分別稱取5份均為50 g的干大豆加150 mL蒸餾水浸泡5 h,蒸煮30 min,接種量為3%,發酵溫度為38℃,發酵時間為24 h,將剛發酵好的納豆放入冰箱4℃后熟,此過程能很大的降低剛發酵好納豆中的氨味,也在此過程中,納豆風味與拉絲狀態得到改良,實驗以后熟時間分別為0、1、2、3、4、5、6 d時測定其NK酶活性和感官評分。

1.2.5感官評價方法感官評價以國內貿易行業標準作為參考[11],由經過專業培訓的七人完成(三男四女),以日本昆布納豆為滿分標準,依次對表1中指標進行評定。鑒評由每人獨立完成,換樣品前溫水漱口,5 min后鑒評下個樣品。

表1　納豆感官評價標準

1.2.6響應曲面實驗根據單因素實驗的實驗結果,選取浸泡時間、蒸煮時間、發酵溫度為自變量,以NK酶活為響應值,運用Box-Behnken的中心組合設計原理,做3因素3水平的響應曲面分析實驗,實驗自變量編碼及水平見表2。

表2　Box-Behnken實驗因素水平表

1.2.7納豆理化指標的檢測方法納豆中氨基酸態氮的檢測方法采用甲醛滴定法[12-13],依照GB/T 5009.39-2003和GB/T 5009.40-2003方法檢測。

水分含量檢測采用直接干燥法[14],依照GB/T 5009.3-2003方法檢測。

1.3數據統計分析

采用expert8.0軟件進行響應曲面實驗設計與分析。采用SAS 8.12進行因子方差分析及Ducan’s多重檢驗(p<0.05)。實驗結果以x±s表示。

2　結果與分析

2.1尿激酶標準曲線

參考謝平會等方法[10]。用工作溶液溶解尿激酶標準品,配制尿激酶母液濃度為1000 U/mL,用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液稀釋尿激酶的濃度為100、150、200、250、300 U/mL,分別移取10 μL點樣于纖維蛋白平板的小孔中,37℃培養18 h,從三個方向測透明圈的直徑,取平均值,計算透明圈的面積,可以得到尿激酶活性與透明圈面積的關系,并繪制標準曲線。如圖1所示,透明圈面積與酶活性呈正相關,R2=0.9932。

圖1　尿激酶活性標準曲線Fig.1　Standard curve of urokinase activity

2.2單因素實驗結果

2.2.1浸泡時間對NK酶活性的影響如圖2所示,NK酶活性隨時間呈現先上升后下降的趨勢,浸泡時間為5 h和10 h時,NK酶活性較低。此時由于大豆的吸水不充分,豆粒內部水活度低,營養運輸受阻,限制了納豆芽孢桿菌的生長。當大豆浸泡時間15 h以上時,由于大豆中水活度過高,菌體在此滲透壓下不適應,影響其生長,進而影響到NK酶活性。因此實驗中選用大豆起始浸泡時間為15 h。

圖2　浸泡時間對NK酶活性的影響Fig.2　Effect of soak time on NK activity

2.2.2蒸煮時間對NK酶活性的影響如圖3所示,NK酶活性隨著蒸煮時間的延長呈現先增大后降低的趨勢,蒸煮時間為在45 min時NK含量達到最高。蒸煮時間為15 min和30 min時,NK酶活性較低,因豆粒內部硬度過大,營養物質結構尚未改變,不足以讓菌體全部吸收利用導致。蒸煮時間過長時,營養成分發生對菌體利用不利的改變。因此選取45 min為最優蒸煮溫度。

圖3　蒸煮時間對NK酶活性的影響Fig.3　Effect of cooking time on NK activity

2.2.3接種量對NK酶活性的影響如圖4所示,在1%接種量時,NK酶活性較低,在2%～4%接種量時酶活性較高,且三個梯度的相差不明顯,在5%接種量時,酶活性有略微降低。原因在于,較低接種量,菌體的遲緩期較長,增加生產周期,且納豆菌數量的不足影響總的代謝產物積累。在2%～5% NK活性近乎不變,說明此接種量范圍,菌體生長代謝良好,接種量的再度過大,菌體生長旺盛,有害代謝產物積累所致NK酶活性下降。實驗選取NK酶活性最高時的接種量3%。

圖4　接種量對NK酶活性的影響Fig.4　Effect of inoculum size on NK activity

2.2.4發酵溫度對NK酶活性的影響如圖5所示,發酵溫度對NK酶活性影響顯著,呈現先升高后降低的趨勢,在34～38℃時逐漸上升,在38℃達到酶活性的最高,隨后顯著下降(p<0.05)。菌種有其最適溫度,在一定范圍內,溫度的升高可以使菌種酶促反應速度增大,細胞代謝旺盛。而溫度過高,使菌體內部酶活性降低,每種酶都有最適的酶促反應溫度,溫度變化影響酶促的反應速率,最終影響NK酶活性。同時溫度過高也可能使NK部分失活。選取38℃作為最適發酵溫度。

圖5　發酵溫度對NK酶活性的影響Fig.5　Effect of fermentation temperature on NK activity

2.2.5發酵時間對NK酶活性的影響發酵時間這一因素較為特殊,前期實驗發現發酵時間影響NK酶活性的同時,隨著發酵時間延長對納豆風味影響很顯著,如果只以NK酶活性為指標,制得NK酶活性很高但風味很差,無法食用的納豆,將會使研究失去意義,特添加感官鑒評來在NK酶活性和風味間尋求一個平衡點。

如圖6所示,發酵時間這一因素對NK活性和風味的影響均較為顯著。NK活力在4～44 h隨發酵時間的延長而逐漸升高,在4～24 h增長迅速,28～44 h區間增長緩慢。同時由于發酵時間的延長,在4～28 h內納豆特征香氣成分不斷增加。自28 h后,因發酵過度導致腐敗味,酸臭味的加重,嚴重影響納豆的風味,納豆感官評價得分顯著下降,綜合評定,選擇最適發酵時間為28 h。

圖6　發酵時間對NK酶活性的影響Fig.6　Effect of fermentation time on NK activity

2.2.6后熟時間對NK酶活性的影響后熟這一環節主要是使納豆特征風味更濃郁并可以較好地減少其中的不良風味,如圖7所示,對NK活性的影響較小,在0～3 d酶活性沒有太大的改變,保持在一定水平上,隨后緩慢地下降。而感官鑒評卻存在有差異,在1 d時納豆的風味較好,后熟完成,綜合評定,選擇1 d作為最適后熟時間。

圖7　后熟時間對NK酶活性的影響Fig.7　Effect of postripeness time on NK activity

2.3響應曲面優化實驗結果

根據Box-Behnken設計的17組實驗進行NK活性的測定結果見表3。

表4　回歸方程的方差分析

利用Design Expert8.0.6.1軟件對表3中實驗數據進行二次線性回歸擬合,得到變量與響應值間的關系的數學模型:Y=2348.68-67.96A-291.35B+101.55C+24.88AB+95.52AC-42.86BC-86.33A2-306.99B2-97.76C2。

表3　Box-Behnken實驗結果

圖8至圖10是根據多元回歸方程的響應曲面圖及等高線圖,可以直觀地反映各因素以及各因素交互作用對NK酶活性的影響。

圖8　Y=(A,B)的響應曲面Fig.8　Response surface and contour plot of A and B

圖9　Y=(A,C)的響應曲面和等高線圖Fig.9　Response surface and contour plot of A and C

從響應曲面的最高點和等高線可以看出,NK酶活性最高點落在中心紅色的區域,也可看到單因素實驗中取所有最優參數的工藝制作出的納豆NK酶活性落在中心區域以外,可以說明響應面優化可以在單因素實驗的基礎上對NK酶活性有進一步的提升。

如圖8所示,發酵溫度不變,納豆發酵的NK酶活性隨浸泡時間的延長呈現先升高后下降的趨勢;當浸泡時間不變時,納豆發酵的NK酶活性隨發酵溫度的升高也呈現先升高后下降的趨勢,兩者共同作于NK酶活性,在浸泡時間12～15.5 h,發酵溫度37.2～37.7℃的區域取得最大值。同時由等高線也可看出,在浸泡時間的改變只改變NK酶活性的區間為2200 U/g至2400 U/g,而發酵溫度的改變卻使NK酶活性在1800 U/g改變至2400 U/g,得出發酵溫度的改變對NK酶活性的影響要大于浸泡時間。

表5　驗證實驗與營養指標的測定

圖10　Y=(B,C)的響應曲面和等高線圖Fig.10　Response surface and contour plot of B and C

綜合圖8～圖10可以得出如下結論,三個自變量間對NK酶活性顯著性為發酵溫度>蒸煮時間>浸泡時間。且在浸泡時間12～15.5 h,發酵溫度37.2～37.7℃,蒸煮時間44～55 min區間內存在極值。

通過擬合的二次回歸方程,得到理論上最優解為浸泡時間14.51 h,蒸煮時間50.55 min,發酵溫度37.48℃。理論NK酶活性達2458.04 U/g。

2.4驗證實驗

由于響應面實驗給出的最優解為理論值,需要驗證實驗確保其精確性。采用上述優化條件發酵納豆,同時選取了2種不同工藝的日本納豆與一種國產納豆,進行了NK酶活性以及氨基酸態氮、水分含量這兩個理化指標的測定。

如表5所示,本實驗所制備的納豆NK酶活性與預測值基本相符,且與北海道、完熟、燕京納豆相比,在NK酶活性方面具有一定的優勢,分別高出16.5%、8.69%和25.22%,具有較高活性。

與此同時,氨基酸態氮為0.42 g/100 g>0.3 g/100 g,水分含量59.13%<65%,完全滿足行業標準SB/T 10528-2009中理化指標的要求。

3　結論

以NK酶活性為主要指標通過單因素實驗確定了浸泡時間、蒸煮時間、接種量、發酵溫度、發酵時間、后熟時間這6個工藝的最佳參數,分別為浸泡時間15 h、蒸煮時間45 min、接種量3%、發酵溫度38℃、發酵時間28 h、后熟時間1 d。

以浸泡時間、蒸煮時間、發酵溫度三個因素作為自變量作3因素3水平的Box-Behnken實驗,得到各因素與響應值的擬合方程:Y=2348.68-67.96A-291.35B+101.55C+24.88AB+95.52AC-42.86BC-86.33A2-306.99B2-97.76C2。判斷出3個因素對NK酶活性影響顯著性依次為:發酵溫度>蒸煮時間>浸泡時間,并確定出NK酶活性最高時的工藝參數為浸泡時間15 h、蒸煮時間51 min、發酵溫度37.5℃,預測NK酶活性最高為2458.04 U/g,通過驗證實驗測得NK酶活性達到2493.33 U/g。

根據納豆行業標準中理化指標的測定,實驗工藝優化的納豆氨基酸態氮為0.42 g/100 g,水分含量為59.13%,均符合行業要求,且含有較高的NK酶活性。

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Optimization of natto processing conditions based on nattokinase activity

LIU Ye,SU Hang,SONG Huan-lu,SU Ke-ran

(School of Food and Chemical Engineering,Beijing Technology and Business University,Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives,Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry,Beijing 100048,China)

To optimize natto processing condition,nattokinase was applied as the index,being determined by agarose-fibrin plate method.The processing condition by single factor experiment was 15 h of soak time,45 min of cooking time,3% of inoculum size,38℃ of fermentation temperature,28 h of fermentation time,and 1 d of postripeness time.The optimal condition by response surface was 15 h of soak time,51 min of cooking time,and 37.5℃ of fermentation temperature.The highest nattokinase activity was 2493.33 U/g.

natto;nattokinase;processing condition;optimization

2015-06-25

劉野(1981-),男,博士,副教授,研究方向:食品風味化學,E-mail:liuyecau@126.com。

國家科技支撐計劃課題(2014BAD04B07);北京市屬高等學校創新團隊建設與教師職業發展計劃項目(IDHT20130506)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)07-0170-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.07.025