響應面法優化楊樹花多糖超聲提取工藝

焉　鑫,王碧瑩,趙家洪,陳雪英,陳儉清,盛尊來

(東北農業大學動物醫學學院,黑龍江哈爾濱 150030)

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響應面法優化楊樹花多糖超聲提取工藝

焉鑫,王碧瑩,趙家洪,陳雪英,陳儉清,盛尊來*

(東北農業大學動物醫學學院,黑龍江哈爾濱 150030)

采用Plackett-Burman設計結合Box-behnken響應面法優化楊樹花多糖的超聲提取工藝。以楊樹花多糖得率為考察指標,對影響楊樹花得率的超聲功率、超聲頻率、提取溫度、提取時間、提取次數、液料比、顆粒大小、醇沉時間、醇沉濃度等9個因素,采用Plackett-Burman設計從中篩選出具有顯著效應的因素-超聲功率、提取溫度、提取時間;進一步以楊樹花多糖得率為考察指標,采用Box-behnken設計響應面法對以上三個因素進行考察,確定最佳工藝條件為:超聲功率195 W,提取溫度66℃,提取時間43 min,以此條件提取的多糖含量為63.18±1.57mg/g,與理論預測值僅相差2%～3%。

楊樹花,多糖,超聲提取,Plackett-Burman設計,Box-behnken設計

楊樹花(Flos populi)為楊柳科(Salicaceae)植物毛白楊(Populus tomentosa)、加拿大楊(Populus canadensis)、或同屬植物的干燥雄花序,味苦性寒,具有清熱解毒,化濕止痢之功效,為《中華人民共和國獸藥典》2010版所收載[1]。楊樹花含有豐富的黃酮及多糖類化合物,目前,對其總黃酮的研究已有較多報道[2-3],但至今對楊樹花多糖的研究較少,尤其缺乏系統的楊樹花多糖提取工藝的研究以及生物活性評價。而大量藥理及臨床研究證實,植物多糖具有增強免疫力、抗氧化、控制血糖、降膽固醇、降血脂等廣泛的生物活性[4-6],作為食品、飼料添加劑等方面具有廣闊的前景[7],因此對楊樹花多糖提取工藝進行優化具有十分重要的意義。

目前,提取植物多糖的方法有熱水浸提法、酸堿溶液提取法、微波提取法、超聲提取法等多種方法[8-9],其中超聲提取法操作簡單,并且可以在較低溫度、較短時間下獲得較高的得率[10],已被開發運用在多種植物活性成分的提取中。超聲提取法需考察的影響因素較多,而Plackett Burman設計結合響應面法可確定影響得率的關鍵因素[11],并對其進行優化。因此,本文在單因素實驗基礎上,采用Plackett Burman設計篩選出影響楊樹花多糖得率的主要因素,進一步采用Box-behnken design響應面法對其進行優化,確定最佳工藝參數。

表1　單因素實驗設計

1　材料與方法

1.1材料與儀器

楊樹花采摘于東北農業大學院內,采收期為2013年9月,經黑龍江中醫藥大學李彥冰教授鑒定為楊柳科植物毛白楊的雄花序;D-無水葡萄糖(No.1108332200503)中國藥品生物制品鑒定所;蒽酮(分析純)上海科峰生物技術有限公司;95%乙醇、硫代巴比土酸、三氯化鐵、脫氧核糖、乙二胺四乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯乙酸、雙氧水、氯仿、正丁醇、濃硫酸、標準葡萄糖等(均為分析純)杭州化學試劑有限公司;1,1-二苯基-2-苦基苯肼自由基(DPPH)、抗壞血酸西格瑪化學試劑公司;所用水為去離子水。

UV-8000A紫外分光光度計上海市元析儀器有限公司;DH6000A電熱恒溫水浴鍋天津市泰斯特儀器有限公司;DHG-9070型熱恒溫鼓風干燥箱上海恒科學儀器有限公司;S224分析天平賽多利斯科學儀器(北京)有限公司。KQ-300VDE三頻數控超聲清洗器昆山市超聲儀器有限公司;RE-52AA旋轉蒸發器上海亞榮生物化學儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1標準曲線的制備及含量測定采用蒽酮-硫酸法[12],取葡萄糖對照品配成100 μg/mL的溶液,分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL溶液置于干燥試管中,加蒸餾水至2 mL,于冰水浴中加入0.2%蒽酮-硫酸溶液4.0 mL,100℃水浴反應10 min,冷卻至室溫后,靜置20 min,于620 nm下測定吸光度。

精密稱取多糖0.1 g,以水溶解并定容至100 mL,精密量取2 mL并定容至10 mL得到楊樹花多糖樣品溶液,精密量取樣品溶液1.0 mL置于10 mL具塞試管中,加蒸餾水至2 mL,于冰水浴中加入0.2%蒽酮-硫酸溶液4.0 mL,100℃水浴反應10 min,冷卻至室溫后,靜置20 min,于620 nm下測定吸光度A,代入回歸方程計算多糖的濃度,每組實驗做3次平行。

1.2.2超聲波提取的工藝流程稱取楊樹花粉→按料液比加水配液→超聲提取→離心分離(3000 r/min,5 min),取上清液→加乙醇,于4℃靜止→離心分離(3000 r/min,5 min)→多糖沉淀。

1.2.3楊樹花多糖提取條件單因素實驗準確稱取楊樹花粉末0.5 g,按照表1的方案分別對各參數進行考察,并依據公式(1)分別測定其在不同功率時多糖的得率(以每克原料藥中含有多糖的毫克數計),確定各因素的中心點。

式(1)

1.2.4響應曲面法實驗設計在Plackett Burman實驗結果基礎上,采用Box-Behnken設計進行實驗,利用Design-expert 8.0軟件對實驗結果進行分析,優化出最佳提取工藝,并對該工藝進行驗證。實驗因子和水平表見表2和表3。

表2　Plackett Burman實驗分析因子及水平表

表3　Box-Behnken實驗分析因子及水平表

1.3數據統計分析

Plackett Burman及Box-Behnken實驗所測得數據,均經Design-expert 8.0軟件進行方差分析(F檢驗),以分析各因素對得率的影響。

2　結果與討論

2.1單因素實驗提取條件選擇

圖1　各單因素對楊樹花多糖得率的影響Fig.1　Effect of different parameters on extraction yield of Polysaccharide from the Flos Populi注:超聲功率(A)、超聲頻率(B)、粒徑大小(C)、提取溫度(D)、提取時間(E)、 液料比(F)、提取次數(G)、醇沉濃度(H)、醇沉時間(I)。

各因素對楊樹花多糖得率影響的結果如圖1所示。由圖1A可知,隨著超聲功率的增大,多糖得率先上升后下降,并在180 W時出現最高點。這是因為功率加大可加大細胞的破碎程度,有利于成分的溶出[13],但功率過大可使更多脂溶性成分溶解而影響多糖的得率。由圖1B可知,與超聲功率相比,超聲頻率對楊樹花多糖得率的影響較小(51.6～56.5mg/g),所以在45 kHz下的超聲頻率足以獲得良好的得率。圖1C表明隨著粒徑變小,多糖得率先上升后下降,并在24目時出現最高點。這是因為粒徑越大與溶劑接觸面積越大,所以先隨粒徑的變小得率增高[14];但如藥粉過細,藥粉本身會對成分產生吸附,反而影響了成分的溶出。提取溫度對楊樹花多糖得率的影響見圖1D,在較低提取溫度下,楊樹花多糖得率仍較高。隨著提取溫度升高,多糖提取得率逐漸上升,直到60℃時達到最高點,然后有所下降。這主要是由于溫度升高使多糖的溶解度增加,并且擴散系數增加,促進提取速度加快[15]。然而溫度過高,一些多糖類化合物被破壞,使得率反而降低。提取時間對楊樹花多糖得率的影響見圖1E,楊樹花多糖得率隨著提取時間的延長而增大,在40 min時達到最大值,繼續延長時間得率變化不大。這說明40 min時已達到溶解平衡。液料比對楊樹花多糖得率的影響見圖1F,隨著液料比的增加,楊樹花多糖的得率也在增加,但由曲線的斜率可知,液料比從25 mL/g增加到35 mL/g時,得率變化不大,為節省溶劑選取25 mL/g液料比進行提取。提取次數對楊樹花多糖得率的影響(圖1G),前三次提取,多糖的得率增加較大(斜率較陡),而3～5次不同提取次數所獲多糖產率相差不大(斜率較緩),說明前三次已能較完全的將多糖從楊樹花藥材溶出。醇沉濃度對楊樹花多糖得率的影響(圖1H),增加醇沉濃度可增加多糖得率,但乙醇濃度達到80%以上時,多糖得率變化不大,并且過高的醇沉濃度會導致雜質的增多,因此醇沉濃度80%時,比較適合獲取楊樹花多糖。醇沉時間對楊樹花多糖得率的影響(圖I),醇沉24 h較醇沉12 h所得多糖產率提高了近16%,而繼續延長醇沉時間,多糖得率變化不大,說明24 h能夠使多糖得以充分的沉淀。

表4　Plackett-Burman實驗設計及響應值

2.2Plackett-Buman實驗設計篩選關鍵因素

在單因素實驗基礎上,確定了Plackett-Buman實驗設計的各個因素和水平,Plackett-Buman實驗設計及響應值見表4,結果利用Design-expert 8.0軟件進行方差分析,確定關鍵因素,結果見表5。

表5　各個因素的顯著性檢查

注:*表示p<0.05,**表示p<0.01。

由表5可以看出,超聲功率(p<0.05)、提取溫度(p<0.01)、提取時間(p<0.01)對得率具有顯著影響。

因此,在下一步采用Box-Behnken響應面設計對其進一步優化。對于不顯著因素,根據單因素實驗結果選取各因素的中心點進行實驗,即依據單因素考察結果,選取超聲頻率45 kHz,粒徑大小24目,液料比30 mL/g,提取次數3次,醇沉濃度80%,醇沉時間24 h。

2.3Box-Behnken設計進一步優化關鍵因素

表7　響應面回歸模型ANOVA分析結果

通過對實驗數據進行多重回歸分析,響應值和實驗的變量關系遵守以下二階多項式方程:

Y=-454.54121+2.00586X1+6.83530X2+4.33832X3+8.26923E-003X1X2-4.53294-003X1X3-0.017527X2X3-6.02869E-003X12-0.057857X22-0.026429X32

X1,X2,X3分別代表超聲功率、提取溫度和提取時間。上述回歸方程的方差分析結果見表7。

表6　楊樹花多糖得率響應面方案及結果

從各個因素的顯著性水平差異可知,對楊樹花得率的影響次序為:提取溫度X2>超聲功率X1>提取時間X3。并且交互項X1X2及二次項X12、X22、X32均對多糖得率具有顯著的影響。

2.3.2響應面分析用Design-Expert.8.0繪制楊樹花多糖提取各個影響參數的響應面,三維的響應面圖和二維的等高線圖(響應面水平方向的投影)的結果見圖2,同時各個影響參數的相互作用也反映在圖中,交互作用的強弱可以從等高線的形狀中反映出來,其中,橢圓形代表兩個因素交互作用較強,圓形則較弱[16]。從圖2可以看出,提取溫度、超聲功率的交互作用較明顯(二維等高線圖為橢圓形),當超聲功率較低時,得率隨溫度的變化并不明顯;當超聲功率較高時,得率隨著溫度的提高而顯著提高,說明適當的提高溫度與功率有利于楊樹花多糖的提取。

圖2　超聲功率(X1)和提取溫度(X2)對得率的響應面分析Fig.2　RSM analysis for interactive effects of ultrasonic power(X1)and extraction temperature(X2)

2.3.3最佳工藝確定及驗證將表3數據經Design-Expert 8.0軟件處理,得到楊樹花多糖的最佳提取條件為:超聲功率為195.7 W、提取溫度為66.5℃、提取時間為43.3 min。考慮到實驗的可操作性,將其調整為超聲功率195 W、提取溫度66℃、提取時間43 min。在此條件下,多糖的得率為63.18±1.57mg/g(N=3),與理論預測值僅相差2%～3%(預測值62.84mg/g),說明優化的模型可靠。

3　結論

單因素實驗最優值結果如下:超聲功率180 W、超聲頻率45 kHz、粒徑大小24目、提取溫度60℃、提取時間40 min、液料比25 mL/g、提取次數3次、醇沉濃度80%、醇沉時間24 h。

本研究的結果表明超聲輔助提取楊樹花多糖是一種有效、操作方便、可靠和可行的方法,其最佳提取工藝條件為超聲功率195 W,提取溫度66℃,提取時間43 min。在此條件下,楊樹花多糖的得率為63.18±1.57mg/g(N=3),與預測值62.84mg/g相近,說明實驗結果與模型符合性良好,所優化的工藝參數準確、可靠。

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Optimization of ultrasound-assisted extraction(UAE)of polysaccharides from Flos Populi with response surface methodology

YAN Xin,WANG Bi-ying,ZHAO Jia-hong,CHEN Xue-ying,CHEN Jian-qing,SHENG Zun-lai*

(College of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin150030,China)

To investigate and optimize the ultrasound-assisted extraction procedure for the water-soluble Polysaccharide from the Flos Populi,important variables and their levels were obtained using Plackett-Burman design and Box-Behnken design.A mathematical model was developed to show the effects of each variable and their combinatorial interactions on extraction yield of Polysaccharide.A high coefficient of determination(R2=98.77%)indicated good agreement between the experimental and predicted values of Polysaccharide yield.The optimum levels of these significant parameters were determined using response surface methodology(RSM),which revealed these as follows:ultrasonic output power 195 W,extraction temperature 66℃,extraction time 43 min.Under these conditions,63.18±1.57mg/g of polysaccharide was extracted,which had a difference of 2%～3% with the predicted value.

Flos Populi;polysaccharides;Ultrasound-assisted extraction;Plackett-Burman design;Box-Behnken design

2015-09-17

焉鑫(1992-)，男，碩士，研究方向：天然藥物化學，E-mail:Elijahy92@163.com。

盛尊來(1979-)，男，博士，副教授，主要從事天然產物分析方面的研究，E-mail:shengzunlai@neau.edu.cn。

國寶自然科學基金(31201944)。

TS255.1

B

1002-0306(2016)07-0164-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.07.024