長雙歧桿菌耐氧菌株選育及其高密度發酵條件的研究

呂秀明,梁金鐘

(哈爾濱商業大學食品科學與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076)

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長雙歧桿菌耐氧菌株選育及其高密度發酵條件的研究

呂秀明,梁金鐘*

(哈爾濱商業大學食品科學與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076)

通過對長雙歧桿菌的紫外誘變,選育出耐氧菌株,命名為L80。以L80為實驗菌株,通過單因素實驗、響應曲面分析和流加補料培養,確定最優培養基方案。高密度培養優化后的方案是(以質量分數計):大豆蛋白胨4.03%,酵母浸粉2.02%,葡萄糖0.95%,水蘇糖1.59%。發酵罐最佳流加方式為:pH6.5,糖濃度保持在6.0～8.0 g/L。最終活菌數達到(1.21±0.03)×1010cfu/mL。

長雙歧桿菌,紫外誘變,高密度培養,響應曲面,流加培養

雙歧桿菌(Bifidobacterium)是由法國巴斯德研究院的Tissier學者于1899年首次從健康吃母乳嬰幼兒的糞便中分離出來的[1]。根據DNA的同源性和糖發酵研究發現,雙歧桿菌屬共分為24個種,而人類來源的只有12個種,其中能在人體腸道內定植并能用于制備保健食品的雙歧桿菌主要有兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium.bifidum)、青春雙歧桿菌(Bifido.adolescentis)、嬰兒雙歧桿菌(Bifido.infantis)、短雙歧桿菌(Bifido.breve)和長雙歧桿菌(Bifido.1ongum)5種[2-3]。它是人體腸道內重要的細菌,是一種有益而無害的生理細菌[4],具有免疫調節、抗腫瘤、抗菌消炎、抗衰老、降血脂、營養、護肝、通便等一系列功能[5-7]。

人體內的雙歧桿菌要在達到一定數量之后才能發揮其益生作用,產品中的雙歧桿菌在保質期內必須保持在106cfu/mL(106cfu/g)以上[8],而且還要在其特定的腸道部位才發揮作用[9]。雙歧桿菌對氧氣的要求較高,要實現其大規模培養,需要嚴格控制環境中的含氧量,這給工業化規模生產雙歧桿菌制品的廠家帶來困難。劉慶玉[10]等人利用紫外誘變得到一株高效木質素降解的菌株;袁輝[11]等人利用紫外誘變獲得一株高產他克莫司的菌株。研究以物理誘變的手段,篩選并馴化獲得一株耐氧菌株。然后以耐氧菌株為研究對象,通過單因素和響應曲面的手段,對培養基進行優化;以優化后的培養基為基礎培養基,通過流加補料發酵培養,從而實現其高密度培養。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

長雙歧桿菌(Bifido.longum)由哈爾濱商業大學食品工程學院發酵工程實驗室提供。

TPY培養基酪蛋白胨12.0 g/L,胰蛋白胨3.0 g/L,大豆蛋白胨3.0 g/L,葡萄糖5.0 g/L,酵母浸粉5.0 g/L,吐溫-80 1.0 mL/L,L-半胱氨酸0.5 g/L,混合鹽溶液10.0 mL/L,121℃滅菌15 min;

混合鹽溶液(100 mL):CaCl20.020 g,KH2PO40.100 g,K2HPO40.100 g,MgSO40.048 g,NaHCO31.000 g,NaCl 0.200 g。

SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺蘇州凈化設備有限公司;PHS-3C型酸度計杭州奧立龍儀器有限公司;V-5000分光光度計上海元析儀器有限公司;SBA-400生物傳感分析儀山東省科學院生物研究所。

1.2實驗方法

1.2.1紫外誘變將制備好的菌懸液(菌濃度為1.03×107cfu/mL)吸取15 mL,在紫外燈瓦數20 W,照射距離30 cm下進行紫外誘變[12]。用磁力攪拌器分別用紫外燈照射30、40、50、60、70、80、90 s。分別吸取誘變不同時間的菌液,將其稀釋101～106倍,吸取0.2 mL涂布,每個稀釋梯度做三組平行,37℃靜置培養48 h。

1.2.2活菌計數在超凈工作臺中,將1 mL種子液接入9 mL已滅菌且充有N2的液體培養基中,置于 37℃培養箱中培養20 h后進行活菌計數。將盛有溶化的無菌瓊脂培養基試管放置于56℃的恒溫水浴中,用無菌注射器分別吸取各個稀釋管的溶液1 mL于融化了的瓊脂培養基試管中,然后將其平放于盛有冰水的盆中滾動,帶菌的溶化培養基在試管內壁立即凝成一薄層。而后置37℃恒溫培養箱中培養。每毫升樣品中含有的雙歧桿菌數量:雙歧桿菌的數量(cfu/mL)=1 mL滾管計數的實際平均值×稀釋倍數。

1.2.3氮源的選擇在TPY培養基基礎上,分別考察大豆蛋白胨、酪蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、胰蛋白胨、蛋白胨、硫酸銨、硝酸鉀8種氮源,質量分數為5.0%,對長雙歧桿菌生長的影響,選出最優氮源。最優氮源按照質量分數為0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%、8.0%。按2%接種量接種于液體培養基中,初始pH7.0,培養溫度37℃,置于恒溫箱內靜置培養20 h,測定培養液的OD600 nm值。

1.2.4碳源的選擇在TPY培養基基礎上,分別考察果糖、蔗糖、乳糖、綿白糖、葡萄糖、麥芽糖6種氮源,質量分數為2.0%,對長雙歧桿菌生長的影響,選出最優碳源。最優碳源按照質量分數為0.10%、0.25%、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%。按2%接種量接種于液體培養基中,初始pH7.0,培養溫度37℃,置于恒溫箱內靜置培養20 h,測定培養液的OD600 nm值。

1.2.5益生元的選擇在TPY培養基基礎上,分別考察水蘇糖、低聚異麥芽糖、低聚果糖3種益生元,質量分數為1.0%,對長雙歧桿菌生長的影響,選出最優益生元。最優益生元按照質量分數為0.2%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%。按2%接種量接種于液體培養基中,初始pH7.0,培養溫度37℃,置于恒溫箱內靜置培養20 h,測定培養液的OD600 nm值。

1.2.6響應曲面實驗因素水平及其編碼

表1　Box-Behnken實驗因素水平及其編碼

1.2.7生長曲線的測定以G-TPY為基礎培養基,按2%的接種量,37℃靜置培養,每隔2 h測定菌體濃度、pH、OD600 nm及還原糖濃度,繪制生長曲線。

1.2.8氫氧化銨中和法高密度培養的研究選擇質量分數28%的氨水為中和劑,利用1L全自動發酵罐,按最終確定的培養基進行發酵,以不流加中和劑作對照,選擇pH5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5,20 h后測定菌濃度。

1.2.9流加補料法高密度培養的研究利用發酵罐自動控制功能,實現自動流加補料控制,每12 h添加50 mL 2.4倍濃縮培養基,保持發酵液pH6.5,糖濃度降至2.0、4.0、6.0、8.0 g/L時補加培養基,使發酵液糖濃度保持在2.0～4.0、4.0～6.0、6.0～8.0、8.0～10.0 g/L測定最大活菌數。

2　結果與分析

2.1紫外誘變選育耐氧菌株

圖1　厭氧菌株和耐氧菌株生長曲線對照Fig.1　Contrast between anaerobic bacteria and oxygen-resistant strain growth curve

將誘變后的菌種涂于平板上,37℃有氧培養。然后挑選200株菌接種于試管內,進行有氧靜置培養,挑選長勢最好的菌株傳代培養,連續培養6代以上使其性狀穩定,挑選一株長勢最好的耐氧菌株進行實驗,該菌株命名為L80。

長雙歧桿菌為嚴格厭氧菌，經過紫外誘變具備一定耐氧能力，由圖1可知,雖然耐氧菌株沒有厭氧菌株長勢好,但是具有較好的耐氧能力,可以在三角瓶中靜止狀態下培養。菌體生長分為延滯期、對數增長期、穩定期及衰減期四個時期。從生長曲線可以看出,在4 h內,為延滯期;4～18 h菌量迅速增長,為對數生長期;20 h后進入穩定期。對數增長期的后期菌體細胞的存活率和活性最強。所以長雙歧桿菌以培養18～22 h為收獲的最佳時期。

2.2長雙歧桿菌的高密度培養

2.2.1培養基的優化

2.2.1.1氮源的選擇由圖2可知,有機氮源比無機氮源長勢好,因為有機氮源中含有長雙歧桿菌直接能利用的氨基酸等物質,無機氮源需要合成或轉化才能得到。而使用有機混合氮源,比單獨使用有機氮源或者無機氮源高,因為酵母粉中有氨基酸、微量元素、生長因子等營養物質,能促進長雙歧桿菌的生長,所以選擇大豆蛋白胨和酵母粉兩種氮源。要使長雙歧桿菌大量增殖,需要營養更加平衡和豐富的培養基,因此兩者必須按照一定的比例混合。采用不同的大豆蛋白胨和酵母粉的比例,維持氮源總量不變進行實驗。由圖3、圖4可知,最終氮源質量分數6.0%,大豆蛋白胨:酵母浸粉比例2∶1,有利于長雙歧桿菌的生長。

圖2　氮源種類對長雙歧桿菌生長影響Fig.2　Effect of nitrogen source on the growth of B.longum

圖3　氮源比例對長雙歧桿菌生長影響Fig.3　Effect of nitrogen ratio on the growth of B.longum

圖4　氮源質量分數對長雙歧桿菌生長影響Fig.4　Effect of nitrogen mass fraction on the growth of B.longum

2.2.1.2碳源的選擇構成細胞物質的基礎是碳源,也是發酵培養基中的主要物質。碳源是否合適,決定長雙歧桿菌吸收和利用碳源時消耗的能量是否適宜。如果碳源不適合,消耗能量過大,不利于長雙歧桿菌的增殖。由圖5可知,碳源為葡萄糖時,菌濃度達到最大,最適合菌體生長。由圖6可知,葡萄糖的質量分數1.00%時最適合。

圖5　碳源種類對長雙歧桿菌生長影響Fig.5　Effect of carbon source on the growth of B.longum

圖6　碳源質量分數對長雙歧桿菌生長影響Fig.6　Effect of carbon mass fraction on the growth of B.longum

2.2.1.3益生元的選擇由圖7可知,水蘇糖、低聚異麥芽糖、低聚果糖均高于對照,說明功能性低聚糖類均能促進長雙歧桿菌的生長,可增殖雙歧桿菌等有益菌。由圖8可知,水蘇糖質量分數為1.5%時最合適。

圖7　益生元種類對長雙歧桿菌生長影響Fig.7　Effect of prebiotics on the growth of B.longum

圖8　水蘇糖質量分數對長雙歧桿菌生長影響Fig.8　Effect of prebiotics mass fraction on the growth of B.longum

表2　Box-Behnken實驗設計及結果

表3　模型回歸方程方差分析

由表3可知,B、C是顯著的,AB、BC交互作用顯著。采用Design-Expert軟件的Optimization模塊,對培養基進行優化,在各個物質實驗添加量的范圍內,預測氮源6.05%,葡萄糖0.95%,水蘇糖1.59%,長雙歧活菌數最大6.86×108cfu/mL。采用上述最佳培養基,實際獲得三組平行數據,平均活菌數為(7.42±0.05)×108cfu/mL,與預測值接近,模型能較好的預測實際發酵液的活菌數。優化后的培養基命名為G-TPY。

圖9　氮源與葡萄糖對長雙歧桿菌生長影響的響應面圖Fig.9　Surface for the effect of nitrogen and glucose on the growth of B.longum

圖10　氮源與水蘇糖對長雙歧桿菌生長影響的響應面圖Fig.10　Surface for the effect of nitrogen and stachyose on the growth of B.longum

圖11　葡萄糖與水蘇糖對長雙歧桿菌生長影響的響應面圖Fig.11　Surface for the effect of glucose and stachyose on the growth of B.longum

2.2.3高密度培養技術的研究

2.2.3.1生長曲線的測定由生長曲線可知,雙歧桿菌在發酵罐中生長良好,培養20 h后發酵液的pH降至4.0左右,最大活菌數不再增加,可能由于較低的pH會抑制雙歧桿菌增殖。可以通過流加堿的方式調節生長過程中發酵液的pH,以提高其穩定期菌體密度。補料時間根據生長曲線中糖的消耗來確定。

圖12　發酵罐培養pH、活菌數、OD600、殘糖量的變化曲線Fig.12　The change curves of pH,the number of living bacterium,the OD600,the amount of residual sugar in fermentation tank culture

2.2.3.2氫氧化銨中和法高密度培養的研究由圖13可知,與不添加中和劑的對比,流加氨水控制pH6.5時長雙歧桿菌的菌體密度較高。過高和過低的pH都不適宜長雙歧桿菌生長,而在菌體培養過程中,pH會逐漸降低,抑制菌體生長,所以通過加入氫氧化銨來保持pH穩定以去除酸脅迫作用。用氫氧化銨作為中和劑,在中和酸后產生的銨離子能被用作氮源,減少鹽脅迫作用。最終菌濃度達到(5.23±0.02)×109cfu/mL。

圖13　pH對長雙歧桿菌生長的影響Fig.13　Effect of pH on growth of B.longum

2.2.3.3流加補料法高密度培養的研究結果如圖14,當糖濃度保持在6.0～8.0 g/L時,活菌數最多。最佳流加方式為:pH6.5,糖濃度保持在6.0～8.0 g/L。三組驗證實驗,活菌數均可達到(1.21±0.05)×1010cfu/mL,實驗方案可行。

圖14　糖濃度對長雙歧桿菌生長的影響Fig.14　Effect of glucose concentration on growth of B.longum

3　結論

在照射距離30 cm,紫外燈瓦數20 W條件下,長雙歧桿菌紫外誘變的最佳方案為:照射時間80 s,得

到一株耐氧菌株L80。以L80菌株為出發菌株,進行培養基優化,優化后的方案為:大豆蛋白胨4.03%,酵母浸粉2.02%,葡萄糖0.95%,水蘇糖1.59%,得到最優培養基G-TPY。以G-TPY為基礎培養基,進行流加補料發酵,最佳流加方式為:pH6.5,糖濃度保持在6.0～8.0 g/L。活菌數提高到(1.21±0.05)×1010cfu/mL。

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Breeding of oxygen-resistant Bifidobacterium longum and its high-density fermentation conditions

LV Xiu-ming,LIANG Jin-zhong*

(Key Laboratory for Food Science and Engineering,Harbin University of Commerce,Heilongjiang Province,Harbin 150076,China)

Through the method of ultraviolet mutagenesis to Bifidobacterium longum,a strain was screened with resistance ability to oxygen,the strain was named L80.Using L80 as the test strain,the optimum culture medium was determined by single factor,response surface and flow and feeding method.High density culture medium optimization formula was(mass fraction)soy peptone 4.03%,yeast extract powder 2.02%,glucose 0.95% and stachyose 1.59%.The optimal fed-batch cultivation was:the sugar concentration was kept in 6.0～8.0 g/L,pH6.5,and the final viable bacteria number was reached(1.21±0.03)×1010cfu/mL.

Bifidobacterium longum;ultraviolet mutagenesis;high density cultivation;response surface;fed-batch cultivation

2015-09-07

呂秀明(1990-)，女，碩士，研究方向：應用微生物與發酵工程，E-mail：lvxiuming0622@163.com。

梁金鐘(1957-)，男，本科，教授，研究方向：應用微生物與發酵工程，E-mail：Ljz2050@126.com。

TS201.3

A

1002-0306(2016)07-0159-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.07.023