L氨基酸氧化酶的誘導表達及生物催化合成5氨基戊酸的研究

馬金蓮,應晗笑,王　璟,曹偉佳,吳　昊,陳可泉

(南京工業大學生物與制藥工程學院,江蘇南京 211816)

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馬金蓮,應晗笑,王璟,曹偉佳,吳昊,陳可泉*

(南京工業大學生物與制藥工程學院,江蘇南京 211816)

L-氨基酸氧化酶可以催化L-氨基酸生成酮酸等化學品,具有重要的應用前景。本研究成功將來源于紅球菌(Rhodococcus opacus)的氨基酸氧化酶在大腸桿菌中表達,并首次用于生物催化合成5-氨基戊酸。結果表明:L-氨基酸氧化酶誘導表達最適溫度為25℃,最適誘導劑濃度0.5 mmol/L,最適誘導時間為7 h,誘導時最佳細胞量為0.246 g/L。催化合成5-氨基戊酸時,最適底物L-賴氨酸(Lys)濃度17 mmol/L,最適pH為7.0,最適溫度為37℃,最適時間為24 h,最適補加0.5% H2O2,添加酶與黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的最適摩爾比為1∶1,最終5-氨基戊酸產量達到16.71 mmol/L。本研究成功的實現了單酶(LAAO)合成5-氨基戊酸,為簡便生物合成5-氨基戊酸奠定基礎。

L-氨基酸氧化酶,誘導表達,酶催化,5-氨基戊酸

L-氨基酸氧化酶(L-amino acid oxidase,LAAO,EC 1.4.3.2)在自然界中分布較廣,它們可以催化氨基酸生成對應的酮酸、氨和雙氧水[1]。LAAO主要從蛇毒中分離[2],但由于蛇毒源酶的獲取困難,表達不易,極大限制了其在酶催化合成中的應用。最近越來越多的非蛇毒源LAAO被發現和報道,主要集中在真菌、細菌、海藻等微生物中[3]。雖然有多種的LAAO的編碼序列已發表[3-4],但由于需要翻譯后酶的修飾[2,5],迄今只有少量LAAO異源表達系統被報道[6-7]。來源于R.opacus的LAAO由于具有廣泛的底物特異性與較高的底物親和力,使得R.opacus在異源表達LAAO的基因篩選中受到廣泛關注[8]。

圖1　5-氨基戊酸機理圖Fig.1　5-aminovaleric acid mechanism map

近年來,研究發現LAAO可有效催化生成5-氨基戊酸,進一步使其成為研究熱點[9]。如圖1所示,LAAO在以Lys為底物作用下生成α-酮酸、氨和雙氧水[1]。α-酮酸在雙氧水作用下生成5-氨基戊酸[10]。目前工業上制備5-氨基戊酸主要使用化學法。一般采用戊內酰胺或戊內酰胺聚合物(尼龍6的熔塊、廢絲、廢棄織物、漁網等)水解后精制而得[11]。這些方法與酶法相比反應條件苛刻,能耗大,設備腐蝕大,效率低,分離復雜[12]。因此開發條件溫和,轉化高效5-氨基戊酸生物合成路線具有重要的現實意義。本研究采用大腸桿菌工程菌MZ505異源表達LAAO,進行酶法合成5-氨基戊酸的研究。為5-氨基戊酸衍生物的研究奠定了基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1菌株本實驗使用菌株為大腸桿菌MZ505,現保藏于中國典型培養物保藏中心(保藏號:CCTCC M2015042)。LAAO基因片段交由Genscript(金斯瑞)構建完成。以R.opacus基因組DNA為模板,以EcoR I和Hind III為酶切位點,以P1(CCGGAATT CATGGCATTCACACGTAGAT)、P2(CCCAAGCTTTCA GGCTTCCTGGGC)為引物連接到載體pET-28a中,隨后將pET-28a(+)轉化進BL21(DE3),構建得到大腸桿菌MZ505。

1.1.2LB培養基蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,氯化鈉5 g/L,固體培養基另加25 g/L瓊脂粉,使用前121℃,15 min高壓蒸汽滅菌。

1.1.3實驗儀器精密pH計PHS-3C上海雷磁儀器廠;紫外可見分光光度計752S上海棱光技術有限公司;生物凈化工作臺SW-CJ-1FD蘇州凈化設備有限公司;電子天平BS124SSartourius公司;高壓蒸汽鍋HVE-85HIRAYAMA公司;離心機LD10北京醫用離心機廠;臺式恒溫振蕩器THZ-D太倉市強樂實驗設備廠;超低溫冰箱MDF-382E(H)三洋電機株式會社。

1.2實驗方法

1.2.1種子培養在50 mL的搖管中接種10 μL含有pET-28a重組質粒的E.coli BL21(DE3)工程菌株于5 mL的LB液體培養基中,加入10 μL的25 g/L卡那霉素(Kana)抗生素。放入37℃搖床中,200 r/min過夜培養。

1.2.2發酵培養在500 mL的搖瓶中接種1 mL上述種子液于100 mL的LB液體培養基中,加入200 μL的25 g/L Kana抗生素培養,當細胞量達到0.246 g/L時加入0.5 mol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),使其終濃度達到0.5 mmol/L于25℃誘導7 h。

1.2.3LAAO粗酶液的制備將誘導后的發酵液在4℃條件下,8500 r/min離心3 min收集菌體,使用菌體兩倍體積pH7.0的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸清洗兩次,最后將菌體重懸于1/10體積的50 mmol/L pH7.0的PBS緩沖液超聲破碎,超聲破碎功率150 W、時間15 min、時間間隔(工作時間∶間歇時間)3∶5(s/s),超聲完畢后的渾濁液 12000 r/min離心20 min,收集上清,獲取LAAO粗酶液。

1.2.4蛋白濃度測定方法考馬斯亮藍法:向試管中加入LAAO粗酶液1 mL及Bradford 4 mL,混勻并室溫靜置3 min,紫外分光光度計測定其吸光值。

1.2.5蛋白表達的測定方法SDS-PAGE電泳[13],配制12.5%分離膠和3.9%濃縮膠,取10 μL酶液與等體積的樣品緩沖液混勻 99℃加熱10 min,4℃冷卻后上樣;跑膠完成后染色20 min后脫色。

1.2.6酶活的測定方法采用1 mmol/L 4-氨基安替比林(AAP)、60 mmol/L苯酚(PA)和7000 U/L辣根過氧化物酶(HRP)的體系測定[14]。分別向具塞試管中依次加入1 mL。Lys溶液100 μL,LAAO粗酶液50 μL,混勻,在37℃下加熱20 min后,煮沸5 min終止反應,在508 nm波長下測定吸光度值。單位酶活(unit)定義為37℃下每分鐘產生1 μmol/L H2O2所需的酶量。

1.2.7誘導表達通過SDS-PAGE發現會生成大量的包涵體,所以對誘導條件進行了優化。LAAO和Lys作用會生成H2O2。H2O2的量可以直觀的反映出酶活的大小,所以測定H2O2的量確定最優的表達條件。

1.2.7.1誘導溫度的優化初始發酵溫度37℃,細胞量生長到0.492 g/L時加入0.5 mol/L IPTG,使其終濃度達到0.75 mmol/L分別于20、25、28、30、37℃誘導5 h。

1.2.7.2誘導時間的優化初始發酵溫度37℃,細胞量生長到0.492 g/L時加入0.5 mol/L IPTG,使其終濃度分別達到0.75 mmol/L在25℃分別誘導1、3、5、7、9 h。

1.2.7.3誘導細胞量的優化初始發酵溫度37℃,細胞量分別生長到0.041、0.123、0.246、0.492、0.656 g/L時加入0.5 mol/L IPTG,使其終濃度分別達到0.75 mmol/L在25℃誘導7 h。

1.2.7.4誘導劑劑量的優化初始發酵溫度37℃,細胞量生長到0.246 g/L時加入0.5 mol/L IPTG,使其終濃度分別達到0.1、0.25、0.5、0.75、1.0 mmol/L在25℃誘導7 h。

1.2.8利用LAAO催化合成5-氨基戊酸各反應條件的優化

1.2.8.1利用LAAO催化合成5-氨基戊酸底物濃度的優化底物濃度分別為10、17、34、51、68 mmol/L與0.8 g/L LAAO粗酶液pH6.5 37℃條件下反應24 h。

1.2.8.2利用LAAO催化合成5-氨基戊酸pH的優化底物濃度為17 mmol/L與0.8 g/L LAAO粗酶液pH分別為5.5、6.5、7.0、7.5、8.0,37℃條件下反應24 h。

1.2.8.3利用LAAO催化合成5-氨基戊酸溫度的優化底物濃度為17 mmol/L與0.8 g/L LAAO粗酶液pH7.0分別為20、25、30、37、40℃條件下反應24 h。

1.2.8.4利用LAAO催化合成5-氨基戊酸時間的優化底物濃度為17 mmol/L與0.8 g/L LAAO粗酶液pH7.0、37℃條件下分別反應3、6、10、16、24、28 h。

1.2.8.5利用LAAO催化合成5-氨基戊酸H2O2的優化底物濃度為17 mmol/L與0.8 g/L LAAO粗酶液中分別添加0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、1%的H2O2,pH7.0、37℃條件下反應24 h。

1.2.8.6利用LAAO催化合成5-氨基戊酸FAD的優化底物濃度為17 mmol/L與0.8 g/L LAAO粗酶液和FAD pH7.0、37℃條件下反應24 h,酶與FAD的比例分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1。

1.2.95-氨基戊酸和L-賴氨酸測定方法高效液相色譜法(安捷倫1290 Infinity系統)色譜柱為C18分析柱(5 μm,250 mm×4.6 mm,Netherlands),流動相A為0.1 mol/L的乙酸鈉溶液(pH通過冰醋酸調節到6.5)∶乙腈=93∶7(V/V);流動相B為乙腈∶水=80∶20(V/V),流速 1 mL/min,進樣體積10 μL,柱溫40℃,利用紫外檢測器檢測,波長為254 nm。具體方法如表1。

表1　高效液相色譜檢測條件

1.3數據統計分析

實驗數據均平行三次,計算平均數和標準方差,作圖統一采用Origin8.0。

2　結果與討論

2.1重組菌大腸桿菌工程菌MZ505的構建及表達

依據R.opacus LAAO氨基酸序列,經過密碼子優化后設計出適合在大腸桿菌表達的DNA序列[15],并交由南京金斯瑞公司合成。合成的LAAO基因通過EcoR I/Hind III位點克隆至質粒pET-28a(+),得到重組質粒pET-28a-LAAO,并轉化至BL21(DE3)中獲得重組菌株MZ505。菌株在37℃條件下誘導(IPTG終濃度1 mmol/L)培養,L-氨基酸氧化酶的表達情況如圖2所示,在57.6 ku大小處為LAAO SDS-PAGE條帶,但是形成了大量的包涵體。

圖2　L-氨基酸氧化酶的SDS-PAGE結果Fig.2　SDS-PAGE of the LAAO from Rhodococcus opacus注：M是蛋白質分子量標準,1,未加誘導劑誘導(37℃)上清;2,未加誘導劑誘導(37℃)沉淀;3,加誘導劑誘導(37℃)上清;4,加誘導劑誘導(37℃)沉淀,箭頭所指示的條帶是LAAO位置。

2.2重組L-氨基酸氧化酶的誘導表達條件優化

2.2.1誘導溫度對菌體產L-氨基酸氧化酶的影響為了研究誘導溫度對菌體產LAAO的影響,結果如圖3所示,隨著溫度的增加,25℃酶活最高。溫度較低時,外源基因的表達量不足,而溫度過高則容易使表達的L-氨基酸氧化酶不能及時轉運至細胞外,在胞內形成無活性的包涵體,所以達不到最高的分泌表達量[16]。因此,25℃是誘導LAAO表達的最佳溫度,H2O2產量達0.353 mmol/L。

圖3　溫度對L-氨基酸氧化酶誘導表達的影響Fig.3　Effects of different induction temperatures on LAAO activity

2.2.2誘導時間對菌體產L-氨基酸氧化酶的影響為了研究誘導時間對菌體產LAAO的影響,結果如圖4所示,加入誘導劑之后開始計時,隨著誘導時間增加,誘導7 h酶活達到最高值。可能是因為誘導時間過長時LAAO的過量表達,超過了細菌的正常代謝水平且菌體分泌表達已穩定,菌體產酶誘導作用沒有明顯變化,因而后期菌體合成LAAO的能力又表現出下降趨勢。誘導時間過短時,菌體分泌表達過低,菌體產酶誘導作用太小而不利于菌體的誘導表達[17-18]。因此,7 h是誘導LAAO表達的最佳時間,H2O2產量達0.744 mmol/L。

圖4　誘導時間的誘導表達Fig.4　Effects of different induction time on LAAO activity

2.2.3誘導時不同細胞量對菌體產L-氨基酸氧化酶的影響為了研究誘導時不同細胞量對菌體產LAAO的影響,結果如圖5可見,隨著細胞量值的增加,在0.246 g/L時加入IPTG,誘導L-氨基酸氧化酶的酶活達到最大值,可能由于最佳誘導時期在重組菌生長到平穩期,此時的細胞數量增速穩定,細胞各種機能健全,分泌系統也已完善,因而利于L-氨基酸氧化酶的分泌表達。在菌體濃度較低時誘導L-氨基酸氧化酶,菌體生長還處于初期,表達效果差,酶活偏低,在菌體濃度高時誘導L-氨基酸氧化酶表達,菌體內各種酶系已趨于成熟,蛋白酶等的切割能力增強,或由于菌體的代謝產物抑制目的蛋白的表達而導致了酶活的下降[17-18]。因此,細胞量值達到0.246 g/L是誘導LAAO表達的最佳細胞量,H2O2產量達 0.798 mmol/L。

圖5　細胞量的誘導表達結果Fig.5　Effects of different cell masses on LAAO activity

2.2.4誘導劑IPTG濃度對菌體產L-氨基酸氧化酶的影響為了研究誘導劑濃度對菌體產LAAO的影響,結果如圖6所示,隨著IPTG濃度的增大,在0.5 mmol/L時酶活達到最大值。當IPTG濃度高于0.5 mmol/L時,酶活迅速降低。這可能是因為由于隨著誘導劑濃度的增加,L-氨基酸氧化酶的表達量也相應增加,而大腸桿菌的分泌能力是有限的,當L-氨基酸氧化酶的表達量低于細胞的分泌力時,酶活持續增加。L-氨基酸氧化酶的表達量高于細胞的分泌力時,會形成大量的包涵體,使得單位蛋白濃度的酶活降低[17]。因此,0.5 mmol/L是誘導LAAO表達的最佳IPTG濃度,H2O2產量達1.167 mmol/L。

圖6　IPTG濃度的誘導表達結果Fig.6　Effects of different IPTG concentrations on LAAO activity

2.2.5單因素最優條件誘導時對菌體產L-氨基酸氧化酶的影響為了研究單因素最優條件誘導時對菌體產LAAO的影響,當菌液的細胞量值為0.246 g/L,加入0.5 mol/L IPTG,其終濃度為0.5 mmol/L,25℃誘導7 h發酵結束,收集菌液。得到的粗酶液檢測酶活,H2O2產量達1.178 mmol/L。

2.3L-氨基酸氧化酶催化合成5-氨基戊酸

2.3.1合成5-氨基戊酸反應中底物濃度的優化據報道,很多酶都會對底物有抑制性作用[19]。為了研究底物對LAAO催化生物合成5-氨基戊酸存在一定的影響，用50 mmol/L pH7.0的PBS將LAAO粗酶液蛋白濃度稀釋為0.8 g/L,LAAO與10～68 mmol/L底物濃度反應24 h,檢測產物的生成量和底物的消耗量。結果如圖7所示,底物濃度低于17 mmol/L時,酶促反應隨著底物的增加而增加;底物濃度高于17 mmol/L時,酶促反應開始隨著底物的增加而下降。可能由于底物濃度增加到一定程度時,底物會對LAAO產生抑制作用。則說明LAAO催化合成5-氨基戊酸最適底物摩爾濃度為17 mmol/L,5-氨基戊酸產量達5.145 mmol/L。

圖7　底物摩爾濃度對合成5-氨基戊酸的影響Fig.7　Effects of substrate concentration on the synthesis of 5-aminovaleric acid

2.3.2合成5-氨基戊酸反應中pH的優化很多酶會隨著環境的變化而變化,尤其pH的影響[20]。為了研究pH對LAAO催化生物合成5-氨基戊酸存在一定的影響，用50 mmol/L pH7.0的PBS將LAAO酶液蛋白濃度稀釋為0.8 g/L,在pH5.5～8.0環境中與17 mmol/L的底物Lys在37℃下反應24 h,檢測其產物的生成量和底物的消耗量。結果如圖8所示,隨著pH的升高,在pH7.0時達到最大值。則LAAO催化合成5-氨基戊酸最適pH為7.0,5-氨基戊酸產量達7.359 mmol/L。

圖8　pH對合成5-氨基戊酸的影響Fig.8　Effects of pH on the synthesis of 5-aminovaleric acid

2.3.3合成5-氨基戊酸反應中溫度的優化酶是蛋白質,可隨溫度的變化而變化[20]。為了研究溫度對LAAO催化生物合成5-氨基戊酸存在一定的影響，用50 mmol/L pH7.0的PBS將LAAO酶液蛋白濃度稀釋為0.8 g/L,分別在20～40℃反應24 h,檢測其產物的生成量和底物的消耗量。結果如圖9所示,隨著溫度升高,37℃時達到最大值。由于LAAO隨溫度升高,酶變性而減少有活性酶的數量從而降低催化效果。則LAAO催化合成5-氨基戊酸最適溫度為37℃,5-氨基戊酸產量達7.709 mmol/L。

圖9　溫度對合成5-氨基戊酸的影響Fig.9　Effects of temperature on the synthesis of 5-aminovaleric acid

2.3.4合成5-氨基戊酸反應中時間的優化反應時間的長短也會對很多酶有一定的影響。為了研究時間對LAAO催化生物合成5-氨基戊酸存在潛在的影響，用50 mmol/L pH7.0的PBS將LAAO酶液蛋白濃度稀釋為0.8 g/L,分別在37℃反應3～28 h,檢測其產物的生成量和底物的消耗量。結果如圖10所示,隨著時間的延長,24 h時反應趨于完全。則LAAO催化合成5-氨基戊酸最適時間為24 h,5-氨基戊酸產量達6.239 mmol/L。

圖10　時間對合成5-氨基戊酸的影響Fig.10　Effects of time on the synthesis of 5-aminovaleric acid

2.3.5合成5-氨基戊酸反應中添加H2O2量的優化L-氨基酸氧化酶生物合成5-氨基戊酸反應中會產生一定量的H2O2,為了研究反應中補加一定量的H2O2對LAAO催化合成5-氨基戊酸產生的影響，用50 mmol/L pH7.0的PBS將LAAO粗酶液蛋白濃度稀釋為0.8 g/L,分別加入0.1%～1%的H2O2反應24 h,檢測其產物的生成量和底物的消耗量。結果如圖11所示,隨著H2O2的補加,對酶促反應有一定的促進作用,過量時會對反應有一定的抑制作用。則最適補加0.5% H2O2,5-氨基戊酸產量達8.752 mmol/L,比未添加提高了近70%。

圖11　H2O2對合成5-氨基戊酸的影響Fig.11　Effects of H2O2 on the synthesis of 5-aminovaleric acid

2.3.6合成5-氨基戊酸反應中添加輔酶的優化酶催化中,輔酶FMN或FAD對電子傳遞起到非常重要的作用,為了研究添加一定量的FAD對LAAO生物催化合成5-氨基戊酸產生一定的影響。分別添加適當0.8 g/L LAAO與FAD摩爾比在1∶1～5∶1的體系中反應24 h,檢測其產物和底物Lys的消耗量。結果如圖12所示,補加一定量的FAD對反應均有促進作用,可能由于LAAO其輔酶是FMN或FAD,使LAAO更好的作用于底物。重組LAAO與FAD摩爾比在1∶1時效果最好,5-氨基戊酸產量達7.034 mmol/L,比未添加提高了近36.7%。

圖12　FAD對合成5-氨基戊酸的影響Fig.12　Effects of FAD on the synthesis of 5-aminovaleric acid

2.3.7合成5-氨基戊酸反應通過對LAAO生物合成5-氨基戊酸反應進行了單因素優化后,將各單因素的最優條件綜合驗證催化效果。在以17 mmol/L底物濃度,添加0.5%的H2O2,酶與FAD的比為1∶1,pH7.0,溫度37℃條件下反應24 h,檢測其產物和底物Lys的消耗量。結果表2所示,經過單因素優化后,5-氨基戊酸的產率達到16.71 mmol/L,相比對照提高了約2.25倍。

表2　優化對照表

3　結論

本實驗從誘導條件方面對其進行單因素優化,通過搖瓶實驗優化單因素所得最佳產L-氨基酸氧化酶誘導條件為當菌液的細胞量值為0.246 g/L,加入IPTG,其終濃度為0.5 mmol/L,25℃誘導7 h,L-氨基酸氧化酶的酶活為1.178 mmol/L,并將其應用于5-氨基戊酸的生產合成中。通過利用LAAO生物催化合成5-氨基戊酸的研究實驗,比較不同條件對5-氨基戊酸產量和賴氨酸的消耗量的研究,結果表明,最適底物濃度為17 mmol/L,最適pH7.0,最適溫度為37℃,最適反應時間為24 h,添加H2O2最適為0.5%,酶與FAD最適的摩爾比為1∶1,產量能達到最大。經過單因素優化后,5-氨基戊酸的產率達到16.71 mmol/L,相比對照提高了約2.25倍。

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Studies on the induction expression of L-amino acid oxidase and its biocatalytic application on the 5-aminovaleric acid

MA Jin-lian,YING Han-xiao,WANG Jing,CAO Wei-jia,WU Hao,CHEN Ke-quan*

(Nanjing Tech University,Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing 211816,China)

L-amino acid oxidase,which catalyze the biosynthesis of keto acid and other chemicals from L-amino acid,is applied in many fields of industry.The LAAO from Rhodococcus opacus was cloned and heterologous expressed in Escherichia coli,followed the investigation of induced conditions and biosynthesis of 5-aminovaleric acid.The results showed that the optimum induction temperature of L-amino acid oxidase was 25℃,The optimal concentration of inducing agent,induction time,the cell mass were 0.5 mmol/L,7 h,0.246 g/L,respectively.Meanwhile,biocatalytic conditions were optimized to improve the production of 5-aminovaleric acid.The optimal substrate molar concentration of biosynthesis of 5-aminovaleric acid was 17 mmol/L,furthermore,the optimal pH,temperature,time,supplemented with H2O2,addition of the enzyme and FAD molar ratio were 7.0,37℃,24 h,0.5%,1∶1,respectively.As a result,a 5-aminovaleric acid concentration of 16.71 mmol/L was achieved.This study successfully realized the single enzyme(LAAO)synthesis of 5-aminovaleric acid,to lay the foundation for the simple biosynthesis of 5-aminovaleric acid.

L-amino acid oxidase;inducible expression;enzymatic;5-aminovaleric acid

2015-08-04

馬金蓮(1990-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：酶催化，E-mail：302832765@qq.com。

陳可泉(1982-)，男，博士，副教授，研究方向：生物催化工程，E-mail：kqchen@njtech.edu.cn。

江蘇省產學研聯合創新資金(BY2014005)；863計劃“2014AA021703”；國家自然科學基金(31440024)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)07-0153-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.07.022