維科天然生物制劑對干酪乳桿菌生長影響的初探

李　丹,任曉靜,陳　婷,奚印慈

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

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維科天然生物制劑對干酪乳桿菌生長影響的初探

李丹,任曉靜,陳婷,奚印慈*

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

利用植物資源開發(fā)新的培養(yǎng)方法來促進(jìn)干酪乳桿菌的生長。在單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),首次對能緩解環(huán)境污染的維科(WIC)天然生物制劑影響干酪乳桿菌生長的條件進(jìn)行初步優(yōu)化。結(jié)果表明,維科天然生物制劑可以促進(jìn)干酪乳桿菌的生長。經(jīng)過響應(yīng)面分析得到的最優(yōu)促生長條件為:溫度39.51℃,培養(yǎng)基起始pH6.16,接種量1.34%,最適維科制劑培養(yǎng)濃度12.56 mg/mL,干酪乳桿菌的實(shí)際OD610 nm值達(dá)2.227,菌落總數(shù)為7.3×109CFU/mL。本研究給該天然生物制劑應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

維科天然生物制劑,干酪乳桿菌,促進(jìn)生長,響應(yīng)面法

維科天然生物制劑由日本維科株式會(huì)社研制,其主要成分為甜葉菊及其殘?jiān)⒕栈ǖ?經(jīng)過萃取、分離精制、制得原液。甜葉菊中含有類黃酮、生物堿、水溶性葉綠素、葉黃素以及中性的水溶性低聚糖、自由糖、氨基酸、脂質(zhì)等[1-4]。同時(shí),它具有高甜度、低熱量、無毒、無副作用等特點(diǎn)[5],已被廣泛應(yīng)用于食品、飲料、醫(yī)藥、日用化工、釀酒、化妝品等行業(yè),實(shí)現(xiàn)了甜葉菊渣低成本、無二次污染的綜合利用。各類學(xué)者對維科天然生物制劑的多種生物活性進(jìn)行了多方面的研究,發(fā)現(xiàn)了其具有抗氧化、抗過敏等多種生物活性,奚印慈發(fā)現(xiàn)維科生物制劑具有很強(qiáng)的抗氧化性,并于1998年在日本食品工學(xué)會(huì)上正式發(fā)表了世界第一篇關(guān)于維科生物制劑抗氧化的論文[5-6]。于慧等人在奚印慈研究基礎(chǔ)上,對維科生物制劑的強(qiáng)抗氧化活性成分進(jìn)行分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定,確定多酚類物質(zhì)是維科生物制劑強(qiáng)抗氧化作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[7]。此外,維科生物制劑還具有預(yù)防高血壓、糖尿病、肥胖癥、心臟病等的功效[8-10]。但關(guān)于維科天然生物制劑在微生物方面的研究較少,盧占軍等人將甜葉菊渣經(jīng)過適當(dāng)?shù)念A(yù)處理,再利用微生物多菌種混合協(xié)同固態(tài)發(fā)酵技術(shù)處理,提高其營養(yǎng)價(jià)值[11]。而本實(shí)驗(yàn)首次探究了維科生物制劑對干酪乳桿菌生長的影響。

干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)是人體腸道內(nèi)的重要微生物[12],具有高效降血壓降膽固醇,并且能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生抗菌素,促進(jìn)細(xì)胞分裂,產(chǎn)生抗體免疫,增強(qiáng)人體免疫及預(yù)防癌癥和抑制腫瘤生長等作用。干酪乳桿菌還具有緩解乳糖不耐癥,緩解過敏等益生保健作用[13]。在干酪乳桿菌優(yōu)化培養(yǎng)條件實(shí)驗(yàn)中影響菌體產(chǎn)量的主要因素有葡萄糖、蛋白胨等[14-15],而維科天然生物制劑富含多糖、多酚、微量元素等特種營養(yǎng)物質(zhì)[8]。

表1　維科生物制劑基本成分[8]

本實(shí)驗(yàn)將維科天然生物制劑以不同的濃度加入培養(yǎng)干酪乳桿菌的培養(yǎng)基中,結(jié)合不同的培養(yǎng)條件,采用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),找出最優(yōu)條件,旨在為開發(fā)一種新的促進(jìn)干酪乳桿菌生長的培養(yǎng)方法提供依據(jù),使得維科天然生物制劑這種利用廢棄植物綜合利用生產(chǎn)的天然生物制劑得到更廣泛的實(shí)際應(yīng)用。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

干酪乳桿菌GL實(shí)驗(yàn)室保存;維科生物制劑由日本維科株式會(huì)社研發(fā)并提供,將甜葉菊及其殘?jiān)⒕栈ǖ韧ㄟ^萃取、分離精制后制得原液[16](質(zhì)量濃度為0.21 g/mL);MRS培養(yǎng)基、MRS肉湯杭州微生物試劑有限公司。

THZ-300型恒溫培養(yǎng)搖床、隔水式恒溫培養(yǎng)箱、LRH-250CL低溫生化培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司;DSX-280B型不銹鋼自動(dòng)手提式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠;便攜式pH計(jì)梅特勒-托利多儀器上海有限公司;BCM型生物潔凈工作臺(tái)蘇凈集團(tuán)安泰公司;T6新世紀(jì)紫外與分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;DGG-9203AD型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;WP800TL23-K3微波爐格蘭仕微波爐電器有限公司。

1.2培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.2.1菌種活化從冰箱中取出分離保存的干酪乳桿菌甘油管菌種,在室溫靜置5 min后以1.0%的接種量接到裝有5 mL液體培養(yǎng)基的試管中(2個(gè)平行),搖勻后37℃靜止培養(yǎng)12 h;之后進(jìn)行劃平板(2個(gè)平行),37℃靜止培養(yǎng)24 h后,挑取單菌落于5 mL液體培養(yǎng)基中(2個(gè)平行),搖勻后37℃靜止培養(yǎng)12 h后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2靜置培養(yǎng)和搖床培養(yǎng)的影響將活化的菌液按1.0%接種量接入裝有5 mL液體培養(yǎng)基的試管中,每組準(zhǔn)備3個(gè)平行,搖勻后37℃靜置培養(yǎng)和60 r/min振蕩培養(yǎng)48 h,每隔12 h取一次樣(先搖勻后取樣),測定培養(yǎng)菌液的OD610 nm值。

1.2.3培養(yǎng)基起始pH的確定將液體培養(yǎng)基的起始pH以10 mol/L HCl、40% NaOH溶液分別調(diào)節(jié)為4、5、6、7和8,以1.0%的活化菌液加入到不同起始pH的液體培養(yǎng)基中(3個(gè)平行),搖勻后37℃恒溫培養(yǎng)12 h,測定培養(yǎng)菌液的OD610 nm值。

1.2.4培養(yǎng)溫度的確定將活化的菌液按1.0%接種量接入液體培養(yǎng)基中(3個(gè)平行),搖勻后分別在30、35、40、45℃條件下培養(yǎng)12 h,測定培養(yǎng)菌液OD610 nm值。

1.2.5接種量的確定將活化的菌液分別按0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的接種量接到液體培養(yǎng)基中,搖勻后37℃恒溫培養(yǎng)12 h,測定培養(yǎng)液OD610 nm值。

1.2.6干酪乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定每隔2 h取樣測定培養(yǎng)液OD610 nm值和活菌數(shù),活菌數(shù)采用平板菌落記數(shù)法(GB/T4789.2-1994),繪制生長曲線。

1.2.7維科天然生物制劑對干酪乳桿菌生長的影響為研究維科天然生物制劑隨濃度變化對干酪乳桿菌生長的影響,來優(yōu)化其培養(yǎng)條件,用二倍稀釋法配制不同濃度的維科生物制劑。取維科天然生物制劑原液(質(zhì)量濃度為0.21 g/mL)400、200、100、50、25、12.5 μL分別加入到含有5 mL的MRS液體培養(yǎng)基中,獲得維科天然生物制劑濃度分別為16.8、8.4、4.2、2.1、1.1、0.55 mg/mL的MRS液體培養(yǎng)基。

將活化后的菌液按照1.0%的添加量添加于含有維科天然生物制劑濃度分別為16.8、8.4、4.2、2.1、1.1、0.55 mg/mL的MRS液體培養(yǎng)基中,以不添加維科天然生物制劑的培養(yǎng)基作空白對照。

培養(yǎng)時(shí)間為48 h,0～12 h內(nèi)每隔6 h測定培養(yǎng)液OD610 nm值,之后每隔12 h測定培養(yǎng)液OD610 nm值,并在12 h時(shí)測定培養(yǎng)液活菌數(shù)。

1.3響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素和水平的選擇

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)所得的結(jié)果,選取其中較佳條件,利用Design Expert 8.0.5軟件進(jìn)行工藝參數(shù)的優(yōu)化組合,采用Box-Behnken的設(shè)計(jì)原理,進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化工藝參數(shù),即選取溫度、pH、接種量、WIC濃度4個(gè)因素作為自變量,以干酪乳桿菌的OD610 nm值作為響應(yīng)值進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)因素和水平見表2。

表2　實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼

2　結(jié)果與討論

2.1靜置培養(yǎng)和搖床培養(yǎng)的影響

由圖1可知,開始時(shí)靜置和搖床培養(yǎng)的OD610 nm值一樣,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,OD610 nm值逐漸增大。在靜置培養(yǎng)和搖床培養(yǎng)的0～12 h時(shí)間內(nèi)菌種迅速生長繁殖,12～24 h時(shí)間內(nèi)生長穩(wěn)定;在整個(gè)培養(yǎng)階段,靜置培養(yǎng)明顯優(yōu)于振蕩培養(yǎng),但搖床培養(yǎng)的菌種也處于生長繁殖狀態(tài),它的OD610 nm值也不斷地增高,結(jié)果表明,干酪乳桿菌適合于靜置培養(yǎng),最適培養(yǎng)時(shí)間為12 h。

圖1　靜置培養(yǎng)和搖床培養(yǎng)OD610 nm值Fig.1　OD610 nm value of static culture and shaking culture

2.2培養(yǎng)基起始pH的確定

由圖2可知,pH為4～8條件下干酪乳桿菌都能穩(wěn)定生長,故其對酸堿環(huán)境的適應(yīng)能力較好。研究者在模擬人體消化道環(huán)境中,對2株干酪乳桿菌耐酸生物學(xué)特性研究。結(jié)果表明,兩株干酪乳桿菌在pH為2.5～4.5的人工胃液或pH為7.6～8.1的人工腸液中作用3 h后均能生長,活菌數(shù)約達(dá)到1010CFU/mL[17]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,培養(yǎng)基起始pH對菌種生長OD610 nm值有一定的影響,其中在pH為4時(shí)生長較為緩慢。

圖2　起始pH對干酪乳桿菌生長的影響Fig.2　Effect of initial pH on the growth of Lactobacillus casei

2.3培養(yǎng)溫度的確定

干酪乳桿菌在不同溫度條件下培養(yǎng)12 h,OD610 nm值結(jié)果見圖3。由圖3可知,培養(yǎng)溫度在30℃時(shí)OD610 nm值為1.187,到35℃時(shí)提高到1.999,而超過35℃后,隨著溫度的提高OD610 nm值有下降趨勢,但下降不是很明顯,說明干酪乳桿菌最適培養(yǎng)溫度為35℃,而且在低溫條件下干酪乳桿菌生長緩慢,在高溫時(shí)也可以生長。研究者以具有較高ACE抑制活性的干酪乳桿菌LC-15發(fā)酵制備酸乳,通過感官評分,確定了干酪乳桿菌LC-15發(fā)酵酸乳的最佳發(fā)酵溫度為37℃[18]。李市場等尋求干酪乳桿菌6028發(fā)酵產(chǎn)酸的最佳條件,結(jié)果發(fā)現(xiàn),34℃時(shí)產(chǎn)酸能力最強(qiáng)[19]。

2.4接種量的確定

由圖4可知,隨著接種量的增多,OD610 nm值也逐漸變大。當(dāng)接種量為0.5%時(shí)OD610 nm值為1.552,接種量為1.0%時(shí)OD610 nm值提高到2.016,有明顯增長趨勢;而接種量為1.0%、1.5%、2.0%時(shí)OD610 nm值差異不明顯。

圖4　接種量對干酪乳桿菌生長的影響Fig.4　Effect of inoculation amount on growth of Lactobacillus casei

2.5干酪乳桿菌生長標(biāo)準(zhǔn)曲線

在培養(yǎng)條件為溫度35℃,時(shí)間12 h,pH為6,接種量為1.0%下,繪制該干酪乳桿菌生長曲線如圖5,OD610 nm值可達(dá)到2.016,活菌數(shù)達(dá)到4.35×109CFU/mL。

圖5　干酪乳桿菌不同培養(yǎng)時(shí)間段OD610 nm值和菌落對數(shù)值Fig.5　OD610 nm value and colonies number value of Lactobacillus casei at different time periods of cultivation

2.6WIC濃度對菌落總數(shù)的影響

在干酪乳桿菌的最佳條件溫度為35℃,時(shí)間為12 h,pH為6,接種量為1.0%時(shí),將活化菌液培養(yǎng)在添加了不同濃度的維科天然生物制劑的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。由圖6,圖7可以看出維科天然生物制劑對干酪乳桿菌具有良好的促進(jìn)作用,隨著WIC濃度的增加干酪乳桿菌的OD610 nm值和菌落對數(shù)值處于明顯的增加趨勢,明顯大于空白組,且在WIC濃度為 16.8 mg/mL時(shí)菌落對數(shù)值增長最為顯著,OD610 nm值達(dá)到2.218,活菌數(shù)達(dá)到6.4×109CFU/mL。結(jié)果顯示了維科天然生物制劑可以促進(jìn)干酪乳桿菌的生長。

圖6　維科天然生物制劑對干酪乳桿菌OD610 nm的影響Fig.6　Effect of WIC natural biologics on OD610 nm value of Lactobacillus casei

圖7　維科天然生物制劑對干酪乳桿菌菌落對數(shù)值的影響Fig.7　Effect of WIC natural biologics on colonies number of Lactobacillus casei

2.7響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)Design Expert 8.0.5軟件對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行安排,實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析見表3～表4。

表3　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4　回歸模型方差分析

注:不顯著(p>0.05),顯著(p≤0.05),極顯著(p≤0.01)。

對響應(yīng)值及各因素進(jìn)行擬合,得到關(guān)于OD610 nm的回歸方程如下:

OD610 nm=-30.70212+0.87494X1+4.60067X2+2.23733X3+0.015030X4-8.73333E-003X1X2-0.015667X1X3+6.98413E-004X1X4-0.088000X2X3-5.05952E-004X2X4+5.53571E-003X3X4-0.010299X12-0.33608X22-0.40383X32-1.81701E-003X42

從表4可知,溫度(X1)對干酪乳桿菌的OD610 nm值影響最大,其次是接種量(X3),pH(X2),WIC濃度(X4);模型p<0.0001,達(dá)到極顯著水平,回歸方程失擬檢驗(yàn)p>0.05,差異不顯著,說明所得的回歸方程擬合比較好。

圖8　各因素交互作用對OD610 nm值的影響Fig.8　Response surface and contour plots showing the interactive effects of extraction parameters on OD610 nm value

響應(yīng)面坡度相對平緩表示兩因素交互作用不顯著,坡度相對較陡表示兩因素交互作用顯著。由圖8可以看出,各因素交互作用對OD610 nm值的影響顯著,該結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。

2.8最佳工藝參數(shù)確定及驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

通過對模型方程解逆矩陣得出促進(jìn)干酪乳桿菌生長的最優(yōu)條件為:溫度為39.51℃,培養(yǎng)基起始pH為6.16,接種量為1.34%,WIC劑濃度為12.56 mg/mL,在此條件下干酪乳桿菌的OD610 nm值達(dá)到2.252,為了驗(yàn)證模型的可靠性,在最優(yōu)條件下對干酪乳桿菌的OD610 nm值進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn),平行實(shí)驗(yàn)3次,干酪乳桿菌的OD610 nm平均值為2.227,與理論預(yù)測值(2.252)接近,菌落數(shù)高達(dá)7.3×109CFU/mL,證明該回歸模型具有可靠性。因此,采用此模型優(yōu)化得到的提取參數(shù)準(zhǔn)確可靠,具有實(shí)用價(jià)值。

3　結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了各參數(shù),結(jié)合驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)確定了促進(jìn)干酪乳桿菌生長的最優(yōu)條件:溫度為39.51℃,培養(yǎng)基起始pH為6.16,接種量為1.34%,維科天然生物制劑濃度為12.56 mg/mL,干酪乳桿菌的OD610 nm值達(dá)到2.227,菌落數(shù)高達(dá)7.3×109CFU/mL。響應(yīng)面分析可見溫度對干酪乳桿菌的OD610 nm值影響最大,其次是接種量,pH,WIC濃度。干酪乳桿菌由于其對宿主營養(yǎng)、免疫、防病等顯著的益生功效,成為研究、開發(fā)、生產(chǎn)的焦點(diǎn),本實(shí)驗(yàn)將植物廢棄資源用到菌種的生長條件中,為開發(fā)新的促進(jìn)益生干酪乳桿菌生長的培養(yǎng)方法及實(shí)際應(yīng)用提供了充分的理論依據(jù),也為充分有效地利用天然植物資源、保護(hù)地球環(huán)境做出了點(diǎn)滴貢獻(xiàn)。

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Effect of WIC natural biologics on the growth of Lactobacillus casei

LI Dan,REN Xiao-jing,CHEN Ting,XI Yin-ci*

(College of Food Science and Techonlogy,Shang hai Ocean University,Shanghai 201306,China)

In order to promote the growth of Lactobacillus casei,a new cultivation method was developed by using plant resources.Making use of response surface methodology based on single factor optimization experiment,it is the first time to optimize the effect of WIC natural biologics primarily,which could alleviate the environmental pollution.The results proved that,WIC natural biologics could positively promote growth of Lactobacillus casei.With the applying of response surface analysis techniques,the optimal promotional growth conditions could be achieved as:the temperature of medium was 39.51℃,the initial pH of medium was 6.16,the inoculation quantity was 1.34%,the optimum concentration of WIC biologics preparation training was 12.56 mg/mL,the actual OD610 nmvalue of Lactobacillus was 2.227,and colonies total number reached 7.3×109CFU/mL at last.This thesis would provide a theoretical basis for the application of natural biologics.

WIC natural biologics;Lactobacillus casei;Promoting growth;Response surface methodology

2015-09-21

李丹(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：天然物質(zhì)生物活性，E-mail：waterker@163.com。

奚印慈(1957-)，女，博士，研究方向：天然物質(zhì)的生物活性成分，E-mail：xiyinci@gmail.com。

上海海洋大學(xué)-日本維科株式會(huì)社合作研究基金項(xiàng)目(D8006-120034)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)07-0148-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.07.021