傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳中高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的篩選與鑒定

陳孝勇,趙　欣,騫　宇,李　鍵,陳煉紅,陳　娟,索化夷,*

(1.西南大學食品科學學院,重慶 400715;2.西南大學 重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心,重慶 400715;3.重慶第二師范學院生物與化學工程系,重慶 400067;4.西南民族大學青藏高原研究院,四川成都 610041;5.西南民族大學生命科學與技術(shù)學院,四川成都 610041)

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傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳中高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的篩選與鑒定

陳孝勇1,2,趙欣3,騫宇3,李鍵4,5,陳煉紅4,5,陳娟5,索化夷1,2,*

(1.西南大學食品科學學院,重慶 400715;2.西南大學 重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心,重慶 400715;3.重慶第二師范學院生物與化學工程系,重慶 400067;4.西南民族大學青藏高原研究院,四川成都 610041;5.西南民族大學生命科學與技術(shù)學院,四川成都 610041)

目的:以四川紅原、西藏羊八井地區(qū)傳統(tǒng)牦牛酸乳中分離出的57株乳酸菌作為實驗菌種,篩選出高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌。方法:通過菌落拉絲法、硫酸-苯酚法的測定。結(jié)果:實驗菌株胞外多糖產(chǎn)量在19.95～91.08 μg/mL之間,其中菌株代號為32-2、67-1、41-1和27的胞外多糖產(chǎn)量較高,分別為91.08、89.76、87.22、87.40 μg/mL。通過16S rDNA序列同源性鑒定表明代號32-2菌株鑒定為屎腸球菌(Enterococcus faecium)、代號67-1菌株為腸膜明串株菌腸膜亞種(Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides)、代號41-1菌株為干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、代號27菌株為腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)。結(jié)論:為研究具有提高酸乳品質(zhì)能力的發(fā)酵菌株提供依據(jù)。

牦牛酸乳,乳酸菌,胞外多糖,篩選,鑒定

保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌是酸奶生產(chǎn)中常用發(fā)酵菌種,但隨著發(fā)酵乳制品多樣化的發(fā)展,傳統(tǒng)乳酸菌發(fā)酵已經(jīng)不能滿足人們對產(chǎn)品的需求,因此,篩選性能良好的乳酸菌對發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)具有重要意義。同時我國酸奶發(fā)酵劑多從國外引進,缺乏自主知識產(chǎn)權(quán)酸奶發(fā)酵劑。張和平等[1]從酸馬奶中得到一株凝乳快速、產(chǎn)酸力強、凝乳質(zhì)地優(yōu)良及益生特性良好的Lactobacillus casei Zhang;Galle等[2]從酸面包中分離出乳酸菌所產(chǎn)胞外多糖可改善發(fā)酵食品的質(zhì)構(gòu);Pradip等[3]從印度發(fā)酵酸奶中分離獲得一株產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵乳桿菌,該菌能夠提高低脂酸奶的感官品質(zhì)及流變學特性。可見,篩選可作為發(fā)酵菌株的乳酸菌已迫在眉睫。我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品極度豐富,如豆豉、醬油、酸馬奶、酸面團等,是構(gòu)建具有自主知識產(chǎn)權(quán)乳酸菌菌種資源庫和開發(fā)自主知識產(chǎn)權(quán)發(fā)酵劑的重要來源。乳酸菌胞外多糖是乳酸菌在生長代謝過程中形成的位于細胞壁外的粘液多糖或莢膜多糖。研究發(fā)現(xiàn)向發(fā)酵乳制品中添加乳酸菌胞外多糖能夠改善發(fā)酵乳制品的流變學特性、質(zhì)構(gòu)和口感等[4]。此外,對胞外多糖的結(jié)構(gòu)、代謝途徑及功能性質(zhì)的研究表明,胞外多糖具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用[5-7]。因此,研究產(chǎn)胞外多糖乳酸菌不僅為改善發(fā)酵乳制品的品質(zhì)研究做出貢獻,提高酸奶益生價值,使性能良好的乳酸菌得以利用,還可以促進EPS分子結(jié)構(gòu)、生理功能與分子作用機制的進一步研究。目前發(fā)現(xiàn)產(chǎn)胞外多糖的常見乳酸菌[8]有干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)、乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcus lactis subsp.lactis)、乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus lactis subsp.cremoris)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)。

牦牛酸乳是我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品之一,是青藏高原地區(qū)牧民喜愛的美食。青藏高原地區(qū)牧民沿襲傳統(tǒng)古老工藝,自然發(fā)酵而成,具有悠久的歷史,經(jīng)過自然長期的選擇和馴化,一些具有獨特優(yōu)良特性的乳酸菌被保留下來。因此,研究牦牛酸奶中的乳酸菌對發(fā)酵乳制品的品質(zhì)及生產(chǎn)均有重要作用。本研究通過對傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳中高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌進行篩選,評價出牦牛酸奶中產(chǎn)胞外多糖能力強的乳酸菌,為探索具有提高酸奶品質(zhì)的自主知識產(chǎn)權(quán)發(fā)酵菌株提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種來源從四川紅原、西藏羊八井地區(qū)的傳統(tǒng)牦牛酸乳中分離出的57株乳酸菌菌株,西南大學食品科學學院保藏。

1.1.2試劑蛋白胨、牛肉膏、吐溫80、磷酸氫二鉀、酵母粉、硫酸鎂、檸檬酸三銨、葡萄糖、蔗糖、硫酸錳、乙酸鈉、瓊脂、透析袋(MD34,截留分子量3000～14000)北京索萊寶科技有限公司。三氯乙酸、乙醇、苯酚、濃硫酸均為分析純成都市科龍化工試劑廠。λDNA/HindⅢ、6×DNA Loading Buffer、100 bp DNA Ladder、細菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)、2×Taq PCR MasterMix天根生化科技(北京)有限公司。上游引物27F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3)、下游引物1495R(5-CTACGGCTACCTTG TTACGA-3)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2儀器與設(shè)備

密封培養(yǎng)罐2.5L日本三菱瓦斯化學株式會社;隔水式恒溫培養(yǎng)箱,GHP-9160上海齊欣科學儀器有限公司;離心機,5810德國Eppendorf公司;磁力攪拌器,78-1常州溴華儀器有限公司;紫外-可見分光光度計,T6新世紀北京普析通用儀器有限責任公司;小型水平電泳槽,Mini-Sub Cell GT美國Bio-Rad公司;梯度PCR儀,S1000 Thermal Cycler美國Bio-Rad公司;潔凈工作臺,SW-CJ-2F蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的初步篩選利用菌落拉絲法[9],將已分離純化的57株乳酸菌在MRS固體篩選培養(yǎng)基上進行劃線分離,并用膠帶將平板封口,在30℃厭氧條件下培養(yǎng)48 h,觀察并記錄菌落特征。用無菌牙簽接觸菌落,輕輕地向外拉,記錄2 s內(nèi)垂直離開培養(yǎng)基表面形成連續(xù)拉絲的最大長度(mm),重復操作5～6個菌落,每個菌落平行做三次,結(jié)果以“平均值±標準方差”來表示,初步篩選能產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌。

1.3.2乳酸菌胞外多糖的提取將菌落拉絲法初篩得到的菌株分別接種于10 mL MRS液體篩選培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)24 h。取10 mL 30℃下培養(yǎng)24 h的乳酸菌培養(yǎng)液,加入250 μL 80%(體積分數(shù))的三氯乙酸,脫除蛋白質(zhì),8000 r/min離心20 min去菌體,離心后的上清液裝入透析袋中置于磁力攪拌器中用蒸餾水透析48 h。透析液中加入3倍體積的95%乙醇,4℃下冷藏過夜,多糖呈絮狀沉淀析出,在4℃、10000 r/min離心20 min,棄掉上清液,收集沉淀溶于10 mL蒸餾水中,備用。

1.3.3乳酸菌胞外多糖含量測定在乳酸菌胞外多糖水溶液中加入6%苯酚溶液和98%濃硫酸,室溫下放置10 min后搖勻,靜置20 min后于490 nm處測定吸光度,以空白培養(yǎng)基為對照,重復操作3次。然后準確稱取50 mg經(jīng)105℃烘干至恒重的葡萄糖于250 mL容量瓶中,蒸餾水定容。稀釋成0、20、40、60、80、100 μg/mL的葡萄糖標準溶液,于490 nm處測定吸光度,根據(jù)結(jié)果繪制成葡萄糖標準曲線。最后按標準曲線方程計算胞外多糖含量。

1.3.4高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建用接種環(huán)接種活化后的高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌于5 mL MRS液體培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)24 h,備用。按細菌基因組DNA提取試劑盒說明書中方法提取高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的總DNA(模板),利用0.7%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。PCR反應(yīng)體系為25 μL:模板1 μL,引物27F、1495R各1 μL,2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL,加無菌超純水補足至25 μL。PCR反應(yīng)條件:94℃ 5 min;94℃ 40 s,55℃ 40 s,72℃ 1 min,共35個循環(huán);72℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后,取5 μL PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,將PCR產(chǎn)物送華大科技有限公司測序,測序結(jié)果提交到NCBI中的GenBank,使用Blast程序?qū)ふ遗c其有最大同源性的序列,最終確定高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的種屬關(guān)系。

表1　乳酸菌在MRS篩選培養(yǎng)基上的粘絲長度

注:“+”表示粘液狀;“-”表示無粘性。

調(diào)取GeneBank數(shù)據(jù)庫中收錄的10個種的10株乳酸菌的相同區(qū)段基因序列,用Clustalx1.83軟件中的Alignment程序?qū)y得序列和BLAST檢索所得參考序列進行多序列匹配比對,再用MEGA5.0軟件中Kimura 2-parameter模式計算遺傳距離,鄰位相連法構(gòu)建分離乳酸菌的同源序列系統(tǒng)進化樹,系統(tǒng)樹的每個分支采用自舉法進行置信度檢測,自舉數(shù)據(jù)集為1000[10-12]。

2　結(jié)果與分析

2.1菌落拉絲法初步篩選產(chǎn)胞外多糖乳酸菌結(jié)果

胞外多糖是長鏈、高分子質(zhì)量的多糖,相對分子質(zhì)量在4.0×104～6.0×106之間,使得產(chǎn)胞外多糖乳酸菌可表現(xiàn)為粘絲狀,故可以通過菌落拉絲法進行初步篩選。57株乳酸菌中有19株菌具有菌落拉絲特性,拉絲長度介于10.8±2.3～43.0±6.2 mm之間,17株菌菌落呈粘液狀,21株菌菌落無粘性。

圖1　MRS篩選培養(yǎng)基上的粘性菌落Fig.1　MRS screening medium viscosity colonies注:A:32-2菌落拉絲圖,B:88粘液菌圖。

2.2硫酸-苯酚法測定乳酸菌胞外多糖含量結(jié)果

經(jīng)測定表明,不同菌株胞外多糖產(chǎn)量有所不同,由表2知,實驗菌胞外多糖產(chǎn)量介于19.95～91.08 μg/mL之間,產(chǎn)量較高的菌株代號為32-2、67-1、41-1和27,產(chǎn)量分別為91.08、89.76、87.22、87.40 μg/mL。Cerning等[13]研究干酪乳桿菌干酪亞種(Lactobacillus casei subsp.casei)的胞外多糖產(chǎn)量在50～155 μg/mL之間,Aslim等[14]從土耳其酸奶中分離出的嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)的最大產(chǎn)量114 μg/mL,Prasanna等[15]研究的嬰兒乳桿菌(Bifidobacterium infantis)的胞外多糖產(chǎn)量為102 μg/mL。馬靜等[16]研究發(fā)現(xiàn)菌種、溫度、pH、發(fā)酵時間以及培養(yǎng)基組分對乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量均有影響,如德氏保加利亞乳桿菌NCFB2772以葡萄糖為碳源的胞外多糖產(chǎn)量是果糖的2倍;Lin等[17]認為發(fā)酵時間是影響胞外多糖產(chǎn)量、分子量和組成的重要環(huán)境因素,向低脂脫脂牛奶中添加干酪素水解物能顯著促進細胞的生長和提高胞外多糖的產(chǎn)量。由此可見,乳酸菌產(chǎn)胞外多糖能力除了與培養(yǎng)條件及營養(yǎng)物質(zhì)的組成有關(guān)外,菌株的不同也是影響乳酸菌產(chǎn)胞外多糖能力的關(guān)鍵因素。

表2　36株乳酸菌產(chǎn)胞外多糖的含量

表3　高產(chǎn)酸菌株鑒定結(jié)果

2.3高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的16S rDNA序列同源性鑒定結(jié)果

16S rDNA鑒定是利用細菌16S rDNA序列測序的方法對細菌進行種屬鑒定,是一種快速獲取細菌種屬信息的方法。由圖2可知,樣品基因組DNA條帶在23130 bp附近,條帶完整,無拖尾。圖3中PCR擴增后的目的片段接近1500 bp,條帶無拖尾現(xiàn)象、清晰明亮,陰性對照無條帶,說明PCR擴增效果較好。16S rDNA比對結(jié)果見表3。

圖2　高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2　Agarose gel electrophoresls of LAB with high exopolysaccharide-producing genomic DNA注:圖2中M為λDNA/HindⅢ,1:32-2,2:27,3:41-1,4:67-1。

圖3　高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3　Agarose gel electrophoresls of LAB with high exopolysaccharide-producing PCR production注:圖3中M為100bp DNA Ladder,0:陰性對照,1:32-2,2:27,3:41-1,4:67-1。

2.4系統(tǒng)發(fā)育分析

系統(tǒng)發(fā)育樹表明不同屬的乳酸菌聚在各自分支內(nèi),分支長度的大小代表物種進化程度的高低。由圖4可知,實驗菌株涉及腸球菌屬、乳桿菌屬和明串珠菌屬,屬于明串珠菌屬的菌株27、67-1以100%的自舉支持率與腸膜明串珠菌處于同一分支上,二者的16S rDNA序列較相似,差異小,親緣關(guān)系較近;屬于腸球菌屬的菌株32-2以79%的自舉支持率與屎腸球菌聚在一起;菌株41-1被明確的分類在乳桿菌屬,因其以63%的自舉支持率在系統(tǒng)發(fā)育樹中與副干酪乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌被分類到一起。此外,菌株41-1似乎與干酪乳桿菌和副干酪乳桿菌具有同樣的關(guān)系(100%的自舉支持率),因為菌株41-1的16S rDNA序列與干酪乳桿菌和副干酪乳桿菌的序列具有非常高的同源性,故而能聚在同一分支。通過系統(tǒng)發(fā)育樹可以得到乳桿菌屬的菌株41-1與腸球菌屬的菌株32-2的情緣關(guān)系較近,與明串珠菌屬的27、67-1的親緣關(guān)系較遠。

圖4　乳酸菌16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4　Phylogenetic tree of LAB based on 16S rDNA sequences

3　結(jié)論

通過對傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳中高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的篩選,得到4株高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌,30℃培養(yǎng)24 h的產(chǎn)量在87.40 μg/mL以上。通過分子生物學鑒定結(jié)果表明,代號32-1菌株為屎腸球菌、代號67-1菌株為腸膜明串株菌腸膜亞種、代號41-1菌株為干酪乳桿菌、代號27菌株為腸膜明串珠菌。四株菌在傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳品質(zhì)形成中具有重要作用,可作為篩選具有提高牦牛酸乳品質(zhì)能力的發(fā)酵菌株。

研究發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳中存在高產(chǎn)胞外多糖腸膜明串珠菌,該種屬菌株高產(chǎn)胞外多糖在發(fā)酵食品中鮮有報道。研究說明腸膜明串珠菌對牦牛酸乳品質(zhì)形成發(fā)揮一定作用。

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Screening and identification of lactic acid bacteria strains with high exopolysaccharide-producing from traditional fermented Yak Yogurt

CHEN Xiao-yong1,2,ZHAO Xin3,QIAN Yu3,LI Jian4,5,CHEN Lian-hong4,5,CHEN Juan5,SUO Hua-yi1,2,*

(1.College of Food Science,Southwest University,Chongqing 400715,China; 2.Chongqing Engineering Research Center of Regional Food,Chongqing 400715,China; 3.Department of Biological and Chemical Engineering,Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China; 4.Institute of Qinghai-Tibetan Plateau,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China; 5.College of Life Science and Technology,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China)

Objective:Screening lactic acid bacteria(LAB)with high exopolysaccharides from 57 strains of lactic acid bacteria,which were isolated and purified from traditional fermented Yak Yogurt in Hongyuan-Sichuan and Yangbajing-Tibet.Methods:The strains with high exopolysaccharides(EPS)were screened by colony thread-drawing method and phenol-sulfuric acid method.Results:The four strains,screening number 32-2,67-1,41-1 and 27,possessed the high exopolysaccharide-producing and the production was 91.08,89.76,87.22,87.40 μg/mL respectively.Based on 16S rDNA sequence analysis,32-2 was identified as Enterococcus faecium,41-1 as Lactobacillus casei,67-1 as Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides,27 as Leuconostoc mesenteroides.Conclutions:This study could provide the evidence for researching fermentation strains to improve yogurt quality.

Yak Yogurt;Lactic acid bacteria;Exopolysaccharide;screening;identification

2015-09-21

陳孝勇(1991-)，男，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵微生物，E-mail：chenxiaoyong522@163.com。

索化夷(1978-)，男，博士，副教授，研究方向：發(fā)酵微生物，E-mail：birget@swu.edu.cn。

國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201203009)；重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計劃項目(CSTC2013JCYJA80006)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)07-0143-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.07.020