L.lactis KLDS4.0325產細菌素發酵培養基的響應面優化

王娜娜,李　婉,于上富,劉　飛,霍貴成

(東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030)

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L.lactis KLDS4.0325產細菌素發酵培養基的響應面優化

王娜娜,李婉,于上富,劉飛,霍貴成*

(東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030)

以分離自新疆牧民家庭自制酸馬奶中的乳酸乳球菌KLDS4.0325為研究對象,以大腸桿菌為指示菌,以抑菌圈直徑為考察指標,通過單因素實驗(碳源、氮源及復合氮源)、Plackett-Burman、最陡爬坡實驗和Box-Behnken實驗優化其產細菌素培養基。PB實驗結果表明,對細菌素產量影響顯著的因素有蔗糖、蛋白胨、抗壞血酸鈉;經Box-Behnken實驗優化后培養基配方為:128.99 g/L蔗糖,17.59 g/L蛋白胨,10 g/L酪蛋白胨,10 g/L磷酸氫二鉀,60 g/L碳酸鈣,1.5 g/L硫酸鎂,1.49 g/L抗壞血酸鈉,1.5 g/Lβ-甘油磷酸鈉,乙酸鈉、氯化鈉、硫酸錳各為1.0 g/L;該條件下抑菌圈直徑為24.76 mm,效價可達5000 U/mL,比優化前提高了3.31倍。并經驗證實驗證明該配方下的實驗結果與預測值吻合,因此該回歸模型是切實可行的。

細菌素,乳酸乳球菌,響應面分析法

細菌素是細菌核糖體合成的抗菌多肽或蛋白,能抑制或殺死與產生菌親源關系相同或相近的微生物[1],它可以作為生物防腐劑應用于食品工業。近幾年,由于細菌素無毒無害(能在胃腸道內被蛋白酶消化),人們越來越關注其作為生物防腐劑在食品工業中的應用[2]。現階段由于細菌素產量的優化和活性的提高能節約生產成本,因此人們以研究其生產和純化為主[3]。

響應面法是一種數據統計方法,能快速分析影響因子及因子間的相互作用,該方法已成功地應用在生物技術的許多方面,包括細菌素產量研究[4],劉國榮等[5]通過響應面法優化彎曲乳桿菌RX-6產細菌素的發酵條件,使效價較優化前提高了2.46倍;魏晉梅等[6]優化了干酪乳桿菌產細菌素培養基,使抑菌性能較優化前有了顯著提高。因此,改變菌株的培養基成分、發酵條件及細菌生長期等因素可提高細菌素產量,從而促進其工業化生產及應用。

乳酸乳球菌KLDS4.0325是東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室從中國新疆牧民家庭自制的酸馬奶中分離的一株乳酸乳球菌,于2013年完成全基因組測序并將序列上傳到Genbank數據庫,登錄號為NC_022593.1[7],分析全基因組序列發現其含有細菌素合成基因簇,并經前期實驗驗證該菌株有產細菌素的能力。因此本研究通過響應面法優化KLDS4.0325產細菌素的培養基組分,提高其產細菌素的能力,從而為該菌株的工業化生產提供切實的理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

乳酸乳球菌KLDS4.0325東北農業大學教育部重點實驗室工業微生物菌種保藏中心(KLDS-DICC)保藏;大腸桿菌Escherichia coli ATCC 25922黑龍江省微生物研究所。

基礎發酵培養基:20 g/L蛋白胨、100 g/L葡萄糖、10 g/L磷酸氫二鉀、0.5 g/L硫酸鎂、60 g/L碳酸鈣,滅菌條件:115℃,滅菌20 min。其中碳酸鈣單獨滅菌121℃,15 min;LB培養基:10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母浸粉、10 g/L氯化鈉。

Nisin標準品、過氧化氫酶美國sigma公司;GL-21M高速冷凍離心機上海市離心機械研究所;恒溫培養振蕩器ZHWY-100B SPX-150B、生化培養箱上海佳勝實驗設備有限公司;CHRISTALPHA1-4型凍干機MarinChrist德國。

1.2實驗方法

1.2.1菌株的活化及KLDS4.0325生長曲線的測定乳酸乳球菌KLDS4.0325活化兩代,以2%接種量接入M17培養基中,置于30℃培養箱中培養,每2 h取樣一次,測定OD600、活菌數及pH。

1.2.2效價測定細菌素效價的測定:根據Cabo等[8]的方法以大腸桿菌ATCC25922為指示菌,繪制標準效價曲線。

1.2.3抑菌活性測定參考于微等人[9]的方法制備無細胞發酵上清液,即菌液10000 r/min,4℃離心15 min,收集上清液,用6 mol/L NaOH調pH到6.5,以排除有機酸的干擾;加入過氧化氫酶使其終濃度為5.0 mg/mL,37℃水浴2 h,以排除過氧化氫的干擾,然后經0.22 μm濾膜過濾,除去菌體及其它雜質,然后冷凍干燥濃縮后備用。采用雙層平板法[10]測定無細胞發酵上清液的抑菌活性。

1.2.4單因素實驗所有單因素實驗選取基礎發酵培養基,初始pH為7.0,條件均為2%接種量,120 r/min,30℃發酵20 h。分別選取100 g/L的麥芽糖、半乳糖、乳糖、果糖、甘露醇、蔗糖替代發酵培養基中的葡萄糖作為唯一碳源,通過抑菌實驗,確定最佳碳源;在最佳碳源的基礎上,進一步確定最佳氮源。在最佳氮源的基礎上進行氮源復配,共設計12組,分別為(1)蛋白胨與酪蛋白胨各10 g/L;(2)蛋白胨與牛肉膏各10 g/L;(3)15 g/L蛋白胨+5 g/L酪蛋白胨；(4)15 g/L蛋白胨+5 g/L牛肉膏;(5)18 g/L蛋白胨+2 g/L酪蛋白胨;(6)18 g/L蛋白胨+2 g/L牛肉膏；(7)蛋白胨、酪蛋白胨、牛肉膏分別為6.67 g/L;(8)蛋白胨、酪蛋白胨、牛肉膏分別為10、5、5 g/L;(9)蛋白胨、酪蛋白胨、牛肉膏分別為12、4、4 g/L;(10)蛋白胨、酪蛋白胨、牛肉膏分別為16、2、2 g/L;(11)蛋白胨、酪蛋白胨、牛肉膏分別為14、4、2 g/L;(12)蛋白胨、酪蛋白胨和牛肉膏分別為12、6、2 g/L,確定最佳組合。

1.2.5Plackett-Burman實驗根據單因素實驗結果,選出蔗糖、蛋白胨以及酪蛋白胨進行Plackett-Burman實驗設計,并選出磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉、β-甘油磷酸鈉、硫酸錳、抗壞血酸鈉、乙酸鈉一同為考察對象,實驗設計見表1,選出對抑菌圈直徑影響較顯著的因素。

表1　PB實驗因素與水平

1.2.6最陡爬坡實驗根據Plackett-Burman實驗結果,確定各因素的顯著性及各顯著因素的正負效應,設計最陡爬坡實驗的變化路徑與變化步長。

1.2.7中心組合實驗根據上述實驗結果確定主要影響因素及其水平進行Box-Benhnken實驗設計,并用Design-Expert軟件分析實驗數據。

表2　BBD實驗因素及水平

1.2.8驗證實驗為了驗證該模型是否可行,以最優培養基配方做驗證實驗,重復三次,結果取平均值。

1.2.9數據統計分析文中所有實驗均進行三次重復實驗，文中圖表運用Excel 2003軟件進行繪制；數據處理采用SPSS軟件和Design-Expet軟件進行統計學分析。

2　結果與討論

2.1KLDS4.0325的生長曲線

由圖1可知，KLDS4.0325在0～4 h活菌數增長最快，而4～8 h內活菌數增長趨勢變緩；在8～20 h期間，活菌數基本穩定，此階段為穩定期，細胞代謝產物積累達到最高峰，是生產的收獲期；在20～24 h期間，活菌數稍有下降，此階段為衰亡期。菌株OD600變化趨勢與活菌數對數值基本一致。pH由初始7.0慢慢下降，在8 h左右開始趨于穩定，說明菌株生長已進入穩定期。綜上，選取20 h為菌株的發酵終點。

圖1　KLDS4.0325的生長曲線Fig.1　The grow curve of KLDS4.0325

2.2細菌素效價標準曲線

細菌素效價標準曲線見圖2,由圖2可知,效價的對數與抑菌圈直徑呈線性相關,回歸方程為Y=6.021X+10.62,Y表示抑菌圈直徑,X表示效價對數值,相關系數0.994,符合進一步實驗要求。

圖2　標準效價曲線Fig.2　Standard titer curve

2.3單因素實驗

2.3.1碳源選擇碳源既是構成微生物細胞的主要元素,還能為細胞生命活動提供所需的能量來源。由圖3可知,蔗糖作為碳源時抑菌圈直徑最大(23.47 mm),該結果與V.Suganthi[11]、閔鐘熳[12]等人的研究結果相一致,這可能與菌株合成細菌素時碳源代謝機制有關,同時以蔗糖為碳源能有效降低工業化生產成本;而菌株對甘露醇的利用率最低,這可能因為菌株合成細菌素時對碳源骨架和所能需能量類型有要求。因此,確定蔗糖為最佳碳源。

圖3　不同碳源對抑菌圈直徑的影響Fig.3　Effect of different carbon sources on inhibitory zone diameter

2.3.2氮源選擇在最佳碳源的基礎上,選擇最佳氮源,結果如圖4,蛋白胨作為氮源時抑菌圈直徑最大,細菌素產量最高,該結果與安俊瑩[13]、韓曦[14]等人的研究結果相一致,其次是酪蛋白胨和牛肉膏,略低于蛋白胨,但為了滿足微生物各種因子的需求,需進行氮源復配。故選取蛋白胨、酪蛋白胨和牛肉膏進行復配。

圖4　不同氮源對抑菌圈直徑的影響Fig.4　Effect of different nitrogen sources on inhibitory zone diameter

2.3.3氮源復配盡管單獨添加蛋白胨時細菌素產量很高,但多種氮源同時使用對菌株生長及細菌素合成都有益處;另一方面,氮源復配可以降低培養基成本,有益于工業化生產。由圖5可知,第1組即10 g/L的蛋白胨與10 g/L的酪蛋白胨的配比效果最好,且抑菌圈直徑高于單獨使用蛋白胨做氮源。這可能由于蛋白胨和酪蛋白胨組合能為菌株提供更為全面的生長因子等微量營養物質,從而促進細菌素的合成,與Lactobacillus acidophilus[15]相比,牛肉膏添加量的改變對其抑菌圈直徑影響不顯著,這可能由于菌株不同對營養因子類型需求不同。綜上,選取10 g/L蛋白胨與10 g/L酪蛋白胨復配進行后續實驗。

圖5　氮源復配對抑菌圈直徑的影響Fig.5　Effect of different mixed nitrogen sources on inhibitory zone diameter

表4　Plackett-Burman 實驗的回歸分析表

注：*表示在p<0.05水平上差異顯著。2.4Plackett-Burman實驗

PB實驗能分析各因素對抑菌圈直徑影響的顯著性,其結果見表3,回歸分析見表4。通過F檢驗分析模型顯著性,當Prob>F值小于0.05時,則該因素對抑菌圈直徑有顯著影響,F值越大表示該因素對抑菌圈直徑影響越大。由結果可知,因素A、B、J 對抑菌圈直徑有顯著影響,其中因素A蔗糖對抑菌圈直徑影響最大,其次為因素B蛋白胨和因素J抗壞血酸鈉,其它因素不顯著,因素E、F、G對抑菌圈直徑的影響為負效應,其它因素為正效應。因此,選擇A蔗糖、B蛋白胨、J抗壞血酸鈉進行最陡爬坡實驗設計,優化其添加量。

表3　Plackett-Burman 實驗結果

2.5最陡爬坡實驗

最陡爬坡實驗可根據各因素的變化路徑及步長確定各因素的中心值,實驗設計及結果見表5,由于因素A、B、J對抑菌圈直徑的影響均為正效應,添加量為從小到大,由表可知,當蔗糖、蛋白胨和抗壞血酸鈉添加量逐漸增大時,抑菌圈直徑呈現增大后減小的趨勢,實驗4即蔗糖、蛋白胨和抗壞血酸鈉添加量分別為110、15和1.5 g/L 時,抑菌圈直徑最大。因此選取實驗4各水平為中心值進行后續實驗設計。

2.6Box-Benhnken實驗設計與分析

以最陡爬坡實驗結果各因素水平值為中心值,設計Box-Benhnken實驗,實驗設計及結果如表6,分析結果見表7。運用F檢驗分析模型是否顯著,回歸方程為Y=23.83+1.37X1+0.71X2-0.31X3+0.60X1X2+0.035X1X3+0.21X2X3-0.99X12-0.74X22-1.29X32。其中Y為抑菌圈直徑,X1、X2、X3分別為蔗糖、蛋白胨、抗壞血酸鈉,對回歸模型進行方差分析,R2值為0.9530,方差越接近1表示實驗值越接近預測值[16],說明回歸方程的擬合程度良好;失擬項為0.4139,大于0.05,因此回歸模型適合;表7中的F值可判斷各因素的顯著性,F值越大,顯著性越高,因此,模型一次項X1、X2顯著,X3不顯著;交互項X1X2顯著,X1X3、X2X3不顯著;二次項X12、X22、X32均顯著,且二次項系數為負值,說明該模型拋物線開口向下,有極大值點,根據回歸方程可得Y的最大值為24.79 mm,此時蔗糖128.99 g/L,蛋白胨17.59 g/L,抗壞血酸鈉1.49 g/L。當蔗糖、蛋白胨和抗壞血酸添加量增大或減少時,抑菌圈直徑都會變小。

表5　最陡爬坡實驗設計及結果

圖6a～圖6c為抑菌圈直徑與蔗糖、蛋白胨、抗壞血酸鈉的三維空間響應面圖,由圖6可知各因素交互作用對抑菌圈直徑的影響,響應曲面坡度越陡,則該因素對抑菌圈直徑影響越顯著,圖6a表示兩個因素交互項顯著,蛋白胨添加量不變時,抑菌圈直徑隨蔗糖添加量的增加而增大,當蔗糖添加量不變時,增加蛋白胨的添加量,抑菌圈直徑也會增大。同理分析圖6b、6c,發現兩圖中兩因素的交互項分別都不顯著。

表6　Box-Benhnken實驗設計及結果

表7　回歸模型方差分析表

注:表示在p<0.05水平上差異顯著，**表示在p<0.01水平上差異極顯著才。

圖6　響應面立體分析圖Fig.6　Response surface stereo analysis diagram

2.7驗證實驗

為檢驗響應面法所得實驗結果的可靠性,以最優培養基配方做驗證實驗,重復3次,得抑菌圈直徑平均值為24.76 mm,與預測值基本一致,因此證明該方案優化的培養基參數是可靠的,該方案是合理有效的。

圖7　驗證實驗結果Fig.7　Result of verification test注:a為優化前;b為優化后。

響應面法已經成功的應用在許多研究中來提高細菌素產量[17-18],V.Suganthi等[11]優化Pediococcus pentosaceus KC692718產細菌素培養基,使細菌素活性提高了2倍;Bing Han等[19]優化Lactobacillus plantarum YJG產細菌素培養基使其產量提高了1.4倍;葛菁萍等[20]優化副干酪乳桿菌HD1.7產Paracin1.7的培養基,優化后效價為141.648 U/mL,提高了1.91倍,但細菌素效價均明顯低于本實驗菌株,且與KLDS4.0325相比,提高倍數也較低。

3　結論

本研究通過單因素實驗、Plackett-Burman、最陡爬坡實驗和Box-Behnken實驗優化乳酸乳球菌KLDS4.0325產細菌素的培養基組分,經優化細菌素效價為5000IU/mL,較優化前提高了3.31倍,優化后培養基配方為128.99 g/L蔗糖,17.59 g/L蛋白胨,10 g/L酪蛋白胨,10 g/L磷酸氫二鉀,60 g/L碳酸鈣,1.5 g/L硫酸鎂,1.49 g/L抗壞血酸鈉,1.5 g/Lβ-甘油磷酸鈉,乙酸鈉、氯化鈉、硫酸錳各為1.0 g/L,并經驗證實驗證明該模型合理可靠,同時也為該菌株的進一步研究及工業化生產提供了切實的理論依據。

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Optimization of fermentation medium for bacteriocin production of L.lactis KLDS4.0325 by response surface methodology

WANG Na-na,LI Wan,YU Shang-fu,LIU Fei,HUO Gui-cheng*

(Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

The fermentation medium composition of L.Lactis KLDS4.0325 isolated from self-made koumiss Xinjiang were optimized for bacteriocin production by single factor experiment(carbon source,nitrogen source,different mixed nitrogen sources),Plackett-Burman,The steepest grade test and Box-Behnken design double-plate method.The inhibitory zone diameter(mm)was used as evaluation index and quantified against Escherichia coli ATCC 25922.PB Experiment results showed that sucrose,peptone and sodium ascorbate had significant influence on bacteriocin production.And finally the optimal combination of the medium constituents for bacteriocin production was determined as:128.99 g/L sucrose,17.59 g/L peptone,10 g/L casein peptone,10 g/L K2HPO4,60 g/L CaCO3,1.5 g/L MgSO4·7H2O,1.49 g/L sodium ascorbate,1.5 g/Lβ-glycerophosphate,CH3COONa·3H2O,NaCl,MnSO4respectively 1.0 g/L.Under the optimal culture condition,the inhibitory zone diameter was 24.76 mm and the bacteriocin inhibitory activity was increased by 3.31 times and reached up to 5000 U/mL.Meanwhile,the consistent results between the prediction and experiments indicated the established model in this study is feasible.

bacteriocin;Lactococcus lactis;response surface methodology

2015-10-16

王娜娜(1990-),女,碩士研究生,研究方向:食品科學,E-mail:wnana1990@163.com。

霍貴成(1958-),男,博士,教授,研究方向:食品微生物與生物技術,E-mail:gchuo58@126.com。

國家863項目(2011AA100902);國家自然科學基金(31401512)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)07-0137-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.07.019