雙功能化無機(jī)介孔材料對(duì)豬胰蛋白酶催化性能的影響

鄒　彬,鄧　甜,韋詩宇,夏姣姣,霍書豪

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

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雙功能化無機(jī)介孔材料對(duì)豬胰蛋白酶催化性能的影響

鄒彬,鄧甜,韋詩宇,夏姣姣,霍書豪

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

通過在SBA-15介孔材料表面引入帶有不同官能團(tuán)及不同親疏水性質(zhì)的修飾劑(-SH,-Cl,-NH2,-C1,-C3,-C8及-C16),改善介孔材料與豬胰蛋白酶的結(jié)合力及蛋白酶所處微環(huán)境,從而提高酶固定化效率,活性及其穩(wěn)定性。結(jié)果表明,官能團(tuán)修飾后載體固定化酶PT-NH2/C8-SBA活性達(dá)到255 U/mg胰蛋白,較之未修飾載體固定化酶PT-SBA活性(195 U/mg胰蛋白)有大幅度的提高;并且重復(fù)使用五次及在室溫下保持5 d后,PT-NH2/C8-SBA活力仍然能保持初始活力的85%及81%。而PT-SBA僅僅保留了初始活性的51%及67%。固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)和催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究表明,底物與固定化酶PT-NH2/C8-SBA具有更好的親和力,固定化酶PT-NH2/C8-SBA有較高的活力和穩(wěn)定性。

介孔材料,雙官能團(tuán),豬胰蛋白酶,表面修飾,固定化

蛋白酶在食品工業(yè)中應(yīng)用廣泛,其中作為食品添加劑是蛋白酶重要應(yīng)用之一。為減少啤酒混濁現(xiàn)象,通常添加蛋白酶以除去啤酒中的蛋白質(zhì)。蛋白酶還可用于牛肉汁、雞汁生產(chǎn)來提高產(chǎn)品收率[1-2]。而游離蛋白酶通常穩(wěn)定性差,自身易團(tuán)聚而失活,易受到溫度、pH影響而活力降低,難從反應(yīng)系統(tǒng)中分離以至于不能重復(fù)使用,使得游離蛋白酶在食品行業(yè)中大規(guī)模化的應(yīng)用難以實(shí)現(xiàn)[3-4]。因此對(duì)游離蛋白酶進(jìn)行改性,為工業(yè)生產(chǎn)提供穩(wěn)定性更好、活性更高、選擇性更專一、極端環(huán)境耐受性更強(qiáng)的新酶品種,對(duì)整個(gè)行業(yè)的發(fā)展至關(guān)重要。

當(dāng)前主要的改造技術(shù)包括固定化技術(shù)[5-6]、化學(xué)修飾以及定位突變技術(shù)[7]。相比定位突變的長(zhǎng)周期性,化學(xué)修飾后酶仍然無法回收利用,酶的固定化技術(shù)是最快速及有效的改造手段。但是蛋白酶直接固定到天然載體材料上,酶分子與載體相互作用力不強(qiáng),導(dǎo)致酶的負(fù)載量低及酶在反應(yīng)時(shí)容易從固定化載體中脫落[8]。此外,酶進(jìn)入載體孔道后,由于載體材料孔道不能提供給酶天然的催化微環(huán)境,相反固定化材料表面帶來的空間位阻對(duì)底物擴(kuò)散、酶的空間構(gòu)象有很大影響,導(dǎo)致酶的活性在固定到材料表面后大幅度降低[9]。

通過引入功能化有機(jī)基團(tuán)對(duì)固定化材料的硅羥基表面進(jìn)行化學(xué)修飾,提高酶與固定化載體之間的結(jié)合力,改進(jìn)固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)是當(dāng)前酶固定化研究的重要內(nèi)容[10-11]。然而目前報(bào)道的修飾方法僅僅針對(duì)解決酶固定化效率及固定化酶穩(wěn)定性,或者單一針對(duì)解決反應(yīng)過程中擴(kuò)散限制效應(yīng)及活性問題[12-14]。同時(shí)提高酶的活性及穩(wěn)定性仍然是酶固定化過程中面臨的難題,Lee等人將豬胰脂肪酶固定化在十二烷基硫酸鈉修飾納米磁性顆粒中,酶催化活性為游離酶的134%,重復(fù)使用五次后降低到初始酶活的50%[15]。

然而活性和穩(wěn)定性同時(shí)提高才是推進(jìn)固定化酶工業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵。因此該工作中,我們通過引入雙功能有機(jī)基團(tuán)對(duì)介孔材料的硅羥基表面進(jìn)行化學(xué)修飾,調(diào)節(jié)載體表面與酶分子之間的電負(fù)性及親疏水作用力,目的在于提高酶在載體表面的負(fù)載量,從而增強(qiáng)固定化酶的穩(wěn)定性。同時(shí)通過功能化基團(tuán)的引進(jìn),改進(jìn)介孔材料表面帶來的底物擴(kuò)散限制及改變酶空間構(gòu)象,提高酶的活性表達(dá)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

豬胰蛋白酶(Porcine trypsin,簡(jiǎn)稱PT)Sigma并在0～4℃下保存,酶蛋白質(zhì)含量為3.8%,最佳活性為300 U/mg酶蛋白(40℃,pH7.0)；固定化酶載體SBA-15(8 nm,SBET633 m2/g)上海卓悅化工有限公司；三甲氧基硅烷(3-氨基丙基),三甲氧基硅烷(3-巰基丙基),三甲氧基硅烷(3-氯丙基)阿拉丁試劑公司,為分析純?cè)噭患妆?鎢酸鈉,鉬酸鈉,磷酸,濃鹽酸,硫酸鋰,液體溴,無水碳酸鈉,三氯乙酸,干酪素,酪氨酸,牛血清蛋白國藥集團(tuán)試劑,未做進(jìn)一步處理。

R1850型離心機(jī)湘儀離心機(jī)有限公司;DSHZ-300A水浴振蕩器杭州艾普儀器設(shè)備有限公司。

1.2功能化介孔材料的合成

在裝有60 mL甲苯的三頸瓶中倒入稱量好的2 g SBA-15載體,然后逐滴加入三甲氧基硅烷(20 mmol),在氮?dú)獗Ｗo(hù)下,于110℃反應(yīng)26 h后過濾,用乙醚洗滌,經(jīng)過24 h二氯甲烷索氏提取后,烘干,得到功能化的固定化載體,記為NH2-SBA,SH-SBA,Cl-SBA。在裝有30 mL甲苯的三頸瓶中倒入稱量好的1 g SBA-15載體,逐滴加入(3-丙基)三甲氧基硅烷,(3-甲基)三甲氧基硅烷,(3-辛基)三甲氧基硅烷或者十六烷基甲氧基硅烷(10 mmol),經(jīng)過反應(yīng)得到雙功能化的固定化載體,記為NH2/C1-SBA,NH2/C3-SBA,NH2/C8-SBA,NH2/C16-SBA[16]。

圖1　載體表面修飾反應(yīng)過程Fig.1　The process of carrier surface modification注:R1為-Cl,-NH2,-SH;R2為-H,-CH2CH3,-(CH2)6CH3,-(CH2)14CH3。

1.3豬胰蛋白酶的固定化過程

將0.05 g豬胰蛋白酶完全溶解于5 mL磷酸緩沖液(pH7.0)中,再加入0.2 g載體,密封并放置于水浴搖床中,在30℃及150 r/min下振蕩0.5,1,1.5,2,2.5,3,3.5,4 h之后,將混合物于8000 r/min離心5 min,用緩沖液洗滌并再次離心,上清液用于測(cè)定酶蛋白負(fù)載量,沉淀通過4 h冷凍干燥后得到固定化酶。

1.4固定化豬胰蛋白酶活性測(cè)試

在10 mL試管中加入固定化酶0.03 g,然后置于40℃水浴中,加入同樣溫度預(yù)熱的水溶液1 mL及1 mL 2%酪蛋白溶液,經(jīng)過10 min反應(yīng)后加入0.4 mol/L三氯乙酸2 mL以停止反應(yīng),8000 r/min離心。然后另取10 mL試管,加入1 mL濾液,1 mL福林試劑及5 mL的0.4 mol/L碳酸鈉溶液,水浴40℃保溫20 min后用紫外分光計(jì)測(cè)定光密度(波長(zhǎng)660 nm)[17-18]。

1.5固定化酶穩(wěn)定性測(cè)試

1.5.1重復(fù)使用穩(wěn)定性將上述1.4過程中,酶活測(cè)定后離心所得固定化蛋白酶進(jìn)行冷凍干燥后,再次進(jìn)行活性測(cè)定(方法見1.4),重復(fù)使用固定化酶活測(cè)定5次。

1.5.2重復(fù)使用過程中蛋白溢出量在10 mL試管內(nèi)加入1.4過程中離心后的上清液1 mL(見1.4),再加4 mL考馬斯亮藍(lán)工作液,在595 nm測(cè)定上清溶液中蛋白質(zhì)含量。對(duì)1.5.1過程中,固定化酶五次重復(fù)使用后離心所得上清液進(jìn)行測(cè)定,得到五次重復(fù)使用過程中酶的總溢出量。

1.5.3儲(chǔ)存穩(wěn)定性將冰箱0～4℃儲(chǔ)存天數(shù)為1,2,3,4,5 d的固定化酶進(jìn)行酶活力測(cè)定。活力測(cè)定過程參考1.4酶活測(cè)試方法。

1.6固定化酶的動(dòng)力學(xué)研究

在10 mL試管中加入0.03 g固定化酶,然后置于40℃水浴中,加入預(yù)熱的水溶液1 mL及1 mL 2%(3%,4%,5%,6%,0.5%,1%)酪蛋白溶液,經(jīng)過3 min反應(yīng)后加入0.4 mol/L三氯乙酸2 mL以停止反應(yīng),8000 r/min離心。在10 mL試管加入1 mL上清液,1 mL福林試劑及5 mL的0.4 mol/L碳酸鈉溶液,水浴40℃保溫20 min后進(jìn)行光密度測(cè)定(波長(zhǎng)660 nm)。

2　結(jié)果與討論

通過分析圖2中不同時(shí)間豬胰蛋白酶的固定化效率,可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)過2 h物理吸附后,各種不同類型載體對(duì)酶的吸附達(dá)到平衡,其中鹵素官能化的載體Cl-SBA固定化效率最高,氨基官能化的載體固定化酶效率次之,但都明顯高于未經(jīng)修飾原粉對(duì)酶的固定化。固定化酶PT-SBA,PT-NH2-SBA,PT-SH-SBA,PT-Cl-SBA在吸附4 h后的固定化效率分別為82%,88%,83%,92%。經(jīng)過分析認(rèn)為表面引進(jìn)基團(tuán)使得載體對(duì)酶的電負(fù)性,氫鍵等相互作用力加大,從而提高了酶的固定化效率[19]。

表1　酶活和胰酶蛋白負(fù)載量測(cè)試結(jié)果

注:a固定化條件:時(shí)間,4 h;溫度,30℃;pH7.0磷酸緩沖液。b反應(yīng)條件:溫度40℃和pH7.0。游離酶活性:300 U/mg胰蛋白,游離酶相對(duì)活性定義為100%，表2同。

表2　酶活和酶蛋白負(fù)載量測(cè)試結(jié)果

圖2　不同官能團(tuán)修飾介孔材料固定化酶效率測(cè)試Fig.2　Enzyme loading of various carriers after modification

從表1固定化酶活結(jié)果顯示,氨基官能化載體固定化酶以及鹵素官能化載體固定化酶表現(xiàn)出了比原粉固定化酶高的蛋白水解活力。而巰基官能化載體固定化酶則表現(xiàn)出較低的活力。經(jīng)過與固定化效率聯(lián)合計(jì)算,可以得出單位豬胰蛋白酶在載體表面的催化活力。結(jié)果表明單位豬胰蛋白酶在氨基官能化的表面催化活力最大,盡管鹵素官能化載體表現(xiàn)出了很優(yōu)秀的固定化效率,但是單位豬胰蛋白酶在載體表面催化活力較在氨基官能化載體表面要低。因此,氨基官能化載體表面為豬胰蛋白酶提供了更好的催化微環(huán)境。通過元素分析儀,可以得到修飾基團(tuán)的具體數(shù)量分別為1.8,2.3,1.9 mmol/g載體。

進(jìn)一步通過改變載體表面親疏水性質(zhì),來調(diào)控氨基官能化載體與豬胰蛋白酶之間的相互作用力,最終提高固定化酶的穩(wěn)定性。通過引入甲基,丙基,辛基以及十六烷基到載體表面(結(jié)果見圖3),發(fā)現(xiàn)隨著載體表面疏水性的增高,豬胰蛋白酶固定化效率逐漸上升,經(jīng)過固定化4 h后,PT-NH2/C1-SBA,PT-NH2/C3-SBA,PT-NH2/C8-SBA,PT-NH2/C16-SBA固定化效率分別為83%,89%,93%,94%。結(jié)果表明,十六烷基官能化的載體很難均勻分散在固定化介質(zhì)中,表現(xiàn)出了較強(qiáng)的疏水性能。

圖3　不同親疏水基團(tuán)修飾介孔材料固定化酶效率測(cè)試Fig.3　Enzyme loading assay after further surface modification

通過在表2中顯示的酶活測(cè)試及酶蛋白負(fù)載量結(jié)果表明,烷基在載體表面的進(jìn)一步修飾有助于表觀酶活的進(jìn)一步提高。隨著疏水性的增加,盡管酶蛋白負(fù)載量有所提升,但是豬胰蛋白酶的活力逐漸降低。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推斷材料表面疏水性的適度增加有助于酶蛋白吸附在載體材料表面,但十六烷基修飾載體固定化酶疏水性能太強(qiáng),雖然提高了酶蛋白的固定化效率,但是降低了酶活性。而辛基修飾載體固定化酶則最大限度的提高了固定化效率,同時(shí)保留了較強(qiáng)的催化性能。通過烷烴的進(jìn)一步修飾,在保持酶活力不變的情況下,提高了豬胰蛋白酶與載體之間的作用了,有助于豬胰蛋白酶的穩(wěn)定性。

對(duì)不同疏水性能的載體固定化酶以及原粉固定化酶進(jìn)行了重復(fù)穩(wěn)定性測(cè)試。圖4顯示,原粉固定化酶重復(fù)穩(wěn)定性最差,初次使用后活性降低為最初活性的51%。而隨著疏水性的增加,固定化酶穩(wěn)定性明顯增加,初次使用后酶活降為67%,77%,85%,88%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明疏水性適度增加能大幅度提高固定化酶的重復(fù)使用穩(wěn)定性。

圖4　固定化酶的重復(fù)使用穩(wěn)定性測(cè)試Fig.4　Reuse stability assay of immobilized enzyme

從蛋白溢出曲線(圖5),發(fā)現(xiàn)固定化豬胰蛋白酶重復(fù)使用后,豬胰蛋白酶酶活降低主要?dú)w因于酶在載體材料表面的溢出,經(jīng)過五次重復(fù)使用后,固定化酶PT-SBA,PT-NH2/C1-SBA,PT-NH2/C3-SBA,PT-NH2/C8-SBA和PT-NH2/C16-SBA酶蛋白溢出量為42%,27%,23%,13%和12%,因此可以確定酶蛋白溢出對(duì)固定化酶重復(fù)使用性有較大的影響。

圖5　固定化酶在重復(fù)使用過程中酶蛋白溢出量測(cè)試Fig.5　Enzyme protein leaching assay in immobilized process

固定化酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性能在工業(yè)應(yīng)用中是比較重要的因素,我們對(duì)常溫下儲(chǔ)存的固定化酶的穩(wěn)定性進(jìn)行了測(cè)試,如圖6所示,測(cè)試結(jié)果表明經(jīng)過雙功能化的固定化酶儲(chǔ)存穩(wěn)定性有所提高。在室溫條件下,儲(chǔ)存5d后,固定化酶PT-SBA,PT-NH2/C1-SBA,PT-NH2/C3-SBA,PT-NH2/C8-SBA和PT-NH2/C16-SBA酶活降低為初始酶活的67%,72%,77%,81%和83%,因此PT-NH2/C8-SBA具有更好的活性和穩(wěn)定性。

圖6　固定化酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性測(cè)試Fig.6　Store stability assay of immobilized enzyme

選取不同底物濃度在最優(yōu)化條件下測(cè)定游離酶和固定化酶的催化活力。根據(jù)米氏方程雙倒數(shù)法討論固定化酶在載體修飾前后的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km及Vmax的變化,結(jié)果見圖7。

圖7　固定化酶的動(dòng)力學(xué)測(cè)試Fig.7　Kinetic studies results of immobilized enzyme

樣品Km(mg/mL)Vamax(umol/min·mg)胰蛋白Vmax/KbmPT-SBA24.041216.3PT-NH2/C8-SBA17.963735.2

注:aKm、Vmax從[S]-V擬合曲線計(jì)算得到;b催化效率定義為Vmax/Km比值。

結(jié)果如表3及圖7所示,發(fā)現(xiàn)固定化酶PT-NH2/C8-SBA展現(xiàn)出了較低的米氏常數(shù)值17.9 mg/mL,米氏常數(shù)值的大小反映了底物分子與酶分子之間的親和力大小,低的米氏常數(shù)表明底物與酶具有很好的親和力,反應(yīng)可以快速進(jìn)行。PT-SBA和PT-NH2/C8-SBA的Vmax分別為412、637 μmol/mg·min,通過比較Vmax可以得出,當(dāng)引入雙官能團(tuán)修飾介孔材料SBA-15,固定化酶的催化活性得到提高,表明有機(jī)官能團(tuán)物質(zhì)的引入有助于酶活中心的打開,促使酶活提升。

3　結(jié)論

本文通過不同官能團(tuán)(-SH,-Cl,-NH2)以及不同碳鏈長(zhǎng)度的烷基鏈(-C1,-C3,-C8及-C16)對(duì)載體SBA-15進(jìn)行雙功能化修飾,研究了不同基團(tuán)修飾載體固定化酶的效率,對(duì)固定化酶的比活力、重復(fù)使用穩(wěn)定性以及儲(chǔ)存穩(wěn)定性等酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了考察。同時(shí)結(jié)合上述結(jié)果對(duì)修飾前后載體固定化酶進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)測(cè)試,發(fā)現(xiàn)合適的官能團(tuán)修飾介孔材料能為豬胰蛋白酶提供良好的微環(huán)境,促進(jìn)了酶活的高效表達(dá)。隨著材料表面疏水性的增加,酶的固定化效率以及穩(wěn)定性增加,但酶活相應(yīng)有所降低,可能是親水性表面有助于打開酶的活性中心,而疏水性的表面則有助于增強(qiáng)豬胰蛋白酶與載體之間的作用力。

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Effect of bifunctional mesoporous material on Porcine trypsin catalytic properties

ZOU Bin,DENG Tian,WEI Shi-yu,XIA Jiao-jiao,HUO Shu-hao

(School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China)

In this paper,binding force between mesoporous materials and trypsin was improved by introducing different modifiers functional groups on the surface of SBA-15(-SH,-Cl,-NH2,-C1,-C3,-C8and-C16)in order to increase the efficiency of enzyme loading,activity and stability.Activity of PT-NH2/C8-SBA could be found up to 255 U/mg trypsin,the activity of PT-SBA was just 195 U/mg trypsin.After the fifth recycle and storage at room temprature of 5 d,PT-NH2/C8-SBA was still able to maintain 85% and 81% of initial activity,while the PT-SBA retained only 51% and 67% of the initial activity.Kinetic studies showed that immobilized enzyme PT-NH2/C8-SBA has better affinity with substrate.

mesoporous;bifunctional;protease;surface modification;immobilization

2015-09-02

鄒彬(1986-)，男，博士，講師，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail:binzou2009@ujs.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(21406093)；江蘇省自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(BK20140529)；國家博士后一等資助(2014M550271)；江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目(14KJB530001)；南京工業(yè)大學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(KL13-10)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)07-0116-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.07.015