植物乳桿菌LB17產γ氨基丁酸培養基優化

尹　然,梁金鐘

(哈爾濱商業大學食品工程學院,黑龍江省高校食品科學與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076)

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尹然,梁金鐘*

(哈爾濱商業大學食品工程學院,黑龍江省高校食品科學與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076)

以植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum Lb-17)為發酵菌株,以發酵產物γ-氨基丁酸產量為檢測參數,對植物乳桿菌發酵產γ-氨基丁酸的發酵培養基進行優化。利用單因素實驗和Box-Behnken響應曲面實驗對發酵培養基進行優化得到最優培養基為:葡萄糖12.0 g/L、酵母粉18.0 g/L、Ca2+55.0 mmol/L、Mg2+60.0 mmol/L、L-谷氨酸鈉26.0 g/L。優化后,植物乳桿菌Lb-17發酵γ-氨基丁酸產量達 8.037 g/L,是優化前5.49 g/L提高1.5倍。

γ-氨基丁酸,發酵條件,優化,植物乳桿菌

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)又名氨酪酸,是由L-谷氨酸或其衍生物在谷氨酸脫羧酶的作用下脫羧而成的一種非蛋白質組成的天然氨基酸,在哺乳動物中是一種重要的抑制性神經遞質。GABA能支配神經系統,而且該系統還參與腦循環調節,攝入GABA可以提高葡萄糖磷酸酯酶的活性,使腦細胞活動旺盛,促進腦組織的新陳代謝和恢復腦細胞功能,改善神經機能[1-2]。GABA能作用于脊髓的血管運動中樞,有效促進血管擴張,達到降低血壓的目的。據報道,黃芪中的有效降壓成分即為GABA[3]。此外,GABA可鎮靜神經、抗焦慮、改善腎機能和肝機能,促進酒精代謝[1]。

γ-氨基丁酸的微生物發酵法是以谷氨酸或其鈉鹽(谷氨酸鈉)或富含谷氨酸的物質等為原料,利用大腸桿菌[4-5]、曲霉菌[6-7]、乳酸菌[8-10]和酵母菌[11-12]等微生物發酵制得,具有成本低、含量高的優點。乳酸菌作為食品安全級微生物,已被廣泛利用于食品和醫藥行業中及畜牧業[13-14]。日本在應用乳酸菌生物合成GABA的方面研究最早[15],在Luctobacillusbrevis IFO-12005對酒糟的發酵過程中,GABA含量達到了10.18 mmol/L[16]。與日本的研究相比,國內的研究起步較晚,發酵水平有很多差距[17-18]。早期通過實驗篩選到乳酸菌株SYFS1.009,經氨基酸自動分析檢測發酵液中的GABA含量,達到200 mg/100 mL[19]。2010年,范杰以分離自泡菜的短乳桿菌為研究對象,對其發酵培養基進行了優化,發酵液中GABA含量達到14.15 g/L[20]。2011年,周青等篩選到一株高產GABA的植物乳桿菌Lactobacillus plantarum WZ011,對發酵培養基進行了優化,發酵液中GABA的產量達到5.814 g/L[21]。2014年,林謙等以酸菜汁為原料,篩選出了一株乳酸菌YS2,對培養基和發酵條件進行了優化,發酵液中GABA的產量達到了5.68 g/L[22]。如今GABA及植物乳桿菌已被中華人民共和國衛生部批準為新資源食品,因此研究植物乳桿菌發酵制備富含GABA 功能性食品更具有現實指導意義。本實驗采用單因素和響應曲面分析法對發酵條件進行優化,旨在探討研究植物乳桿菌產γ-氨基丁酸的諸多因素,以提高γ-氨基丁酸的產量,為今后工業化生產γ-氨基丁酸提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

植物乳桿菌Lb-17(Lactobacillus plantarum Lb-17)由哈爾濱商業大學食品工程與科學重點實驗室保藏。

γ-氨基丁酸(≥99%)上海源葉生物科技有限公司;硅膠板浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠;正丁醇、冰乙酸天津市天力化學試劑有限公司;水合茚三酮天津市巴斯夫化工有限公司;次氯酸鈉天津市風船化學試劑有限公司;苯酚天津市科密歐化學試劑開發中心;無水乙醇天津市津東天正精化學試劑廠;四硼酸鈉天津市博迪化工有限公司;硼酸哈爾濱市化工試劑廠;碳酸鈉天津市天力化學試劑有限公司。

BS 224S電子天平賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;LRH-生化培養箱上海一恒科技有限公司;723N可見分光光度計上海精密科學儀器有限公司;H1650-W臺式高速離心機湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.2培養基

菌種活化、保藏及分離培養基(MRS培養基):蛋白胨10.0 g/L、酵母粉2.0 g/L、牛肉粉10.0 g/L、無水乙酸鈉5.0 g/L、檸檬酸氫二銨2.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、MnSO40.05 g/L、K2HPO42.0 g/L,吐溫-80 1.0 mL,自然pH;固體培養基:液體培養基中加入瓊脂20.0 g/L(121℃,滅菌15 min)。

發酵培養基(TYG培養基):胰蛋白胨5.0 g/L、葡萄糖10.0 g/L、酵母粉5.0 g/L、丁二酸鈉5.0 g/L、L-MSG 10.0 g/L,自然pH(105℃,滅菌20 min)。

1.3液體培養條件

按體積分數2%的初始接種量將種子液接入試管發酵培養基中,試管裝液量15 mL/30 mL,用硅膠塞密封,溫度37℃,靜置培養72 h。

1.4培養基組分優化

1.4.1碳源種類及濃度對GABA發酵的影響分別以5.0 g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、丁二酸鈉、乳糖作為碳源進行發酵實驗,測定發酵液中GABA質量濃度,從而篩選出最佳碳源。而后分別向基礎發酵培養基TYG中添加5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 g/L的葡萄糖,37℃靜置培養72 h,測定發酵液中GABA質量濃度,確定合適的葡萄糖質量濃度。

1.4.2氮源種類及濃度對GABA發酵的影響分別向基礎發酵培養基中添加8.0 g/L的胰蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、蛋白胨、酪蛋白胨、蛋白胨、硫酸銨作為氮源進行發酵實驗,測定發酵液中GABA質量濃度,從而篩選出最佳氮源。而后分別向基礎發酵培養基TYG中添加5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 g/L的酵母粉,37℃靜置培養72 h,測定發酵液中GABA質量濃度,確定合適的酵母粉質量濃度。

1.4.3底物對GABA發酵的影響在基礎發酵培養基TYG中分別加入10.0、20.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0 g/L的L-谷氨酸鈉,確定最適的底物質量濃度。

1.4.4無機鹽對GABA發酵的影響選取CaCl2、MgSO4、MnSO4、KH2PO4、NaCl,分別以5.0 mmol/L離子濃度添加到基礎培養基TYG中進行發酵實驗,測定發酵液中GABA質量濃度,從而篩選出最佳無機鹽。而后分別向基礎發酵培養基TYG中添加10.0、20.0、30.0、40.0、50.0、60.0 mmol/L的CaCl2和MgSO4,37℃靜置培養72 h,測定發酵液中GABA質量濃度,確定合適的CaCl2和MgSO4離子濃度。

1.5GABA含量測定

Berthelot改良比色法[23]標準曲線的繪制:配制質量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 g/L的GABA標準溶液。取0.4 mL不同質量濃度的GABA標準溶液,分別加入1 mol/L的Na2CO3溶液0.1 mL;0.2 mol/L pH9.0的四硼酸鈉緩沖溶液0.5 mL;質量濃度為6 g/100 mL的苯酚水溶液1 mL;含有10%有效氯的次氯酸鈉溶液1 mL,振蕩混勻,放置10 min。然后沸水浴10 min;最后冰浴20 min,待溶液出現藍綠色后加入體積分數為60%乙醇水溶液2 mL,振蕩混勻,放置30 min。在640 nm波長處測定其光密度值,并做平行樣。最后以GABA的質量濃度為橫坐標,640 nm處OD為縱坐標繪制標準曲線。

發酵液中GABA產量的測定:取一定量發酵液,常溫條件下,12000 r/min離心5 min,將上清液稀釋10倍后取0.4 mL,按標準曲線測定方法測定發酵液中GABA含量。以發酵培養基為空白對照。

圖1　GABA標準曲線Fig.1　GABA standard curve

1.6響應面分析法

根據前期實驗結果選取對GABA產量影響顯著的五個因素:葡萄糖(g/L)、酵母粉(g/L)、Ca2+(mmol/L)、Mg2+(mmol/L)、L-谷氨酸鈉(g/L)在發酵培養基中的組分含量為自變量,采用Box-behnken設計,以GABA產量(g/L)為響應值設計響應面實驗,因素水平表見表1。

表1　響應面實驗因素水平表

2　結果與分析

2.1原始發酵培養基中GABA含量的測定

將在37℃靜止培養72 h的原始發酵培養基,按照1.5所述的GABA含量測定方法進行平行測定,所得GABA含量為5.49 g/L。

2.2碳源種類及濃度對GABA發酵的影響

如圖2可知,植物乳桿菌Lb-17利用葡萄糖發酵產GABA的能力明顯好于其它碳源,確定最佳碳源為葡萄糖。由圖3所示,葡萄糖質量濃度10.0 g/L,GABA產量最大為7.896 g/L;推測原因為一般種子培養基中葡萄糖含量不能太高,因為糖分過多,菌體代謝活動旺盛,產生有機酸,使pH降低,容易引起菌種衰老從而影響GABA的產量[24]。

圖2　碳源對Lb-17產GABA的影響Fig.2　Effect of carbon sources on the production of GABA

圖3　不同質量濃度葡萄糖對Lb-17產GABA的影響Fig.3　Effect of glucose concentration on the production of GABA

2.3氮源種類及濃度對GABA發酵的影響

結果如圖4可知,最佳氮源為酵母粉,添加硫酸銨菌體產GABA最小,這是因為酵母粉中含有豐富的營養成分及植物乳桿菌生長所需的生長因子,從而促進菌體的生長代謝,而無機氮源不能提供菌體產GABA所需的營養物質。根據圖5所示,酵母粉質量濃度15.0 g/L,GABA產量最大為6.517 g/L;推測原因為酵母粉濃度不斷增加導致菌體過度生長而不產谷氨酸脫羧酶[25]。

圖4　氮源對Lb-17產GABA的影響Fig.4　Effect of nitrogen sources on the production of GABA

圖5　不同質量濃度酵母粉對Lb-17產GABA的影響Fig.5　Effect of yeast concentration on the production of GABA

2.4底物對GABA發酵的影響

結果如圖6可知,當培養基中L-谷氨酸鈉質量濃度為20.0 g/L時,發酵液中GABA質量濃度最大,為7.743 g/L,但當L-谷氨酸鈉添加量大于20.0 g/L時,GABA質量濃度降低,可能是由于底物濃度過量,菌體內的谷氨酸脫羧酶不足,產生底物抑制,導致γ-氨基丁酸的產量逐漸降低[25]。

圖6　L-谷氨酸鈉對Lb-17產GABA的影響Fig.6　Effect of L-MSGon the production of GABA

2.5無機鹽對GABA發酵的影響

結果如圖7所示,最佳無機鹽為MgSO4和CaCl2,GABA質量濃度分別為6.712 g/L和7.081 g/L,加入MnSO4的培養基GABA的產量最低,可能原因為鎂構成某些酶的活性成分,鈣離子是某些酶的激活劑,Mg2+、Ca2+可以激活谷氨酸脫羧酶的活性,使GABA產量增加,Mn2+抑制酶的活性,使GABA產量減少[25]。結果如圖6可知,當培養基中CaCl2、MgSO4離子濃度分別為50.0、60.0 mmol/L時,發酵液中GABA質量濃度最大分別為8.014、7.982 g/L。但隨著CaCl2和MgSO4添加量的提高,GABA質量濃度降低,可能原因為CaCl2和MgSO4濃度過高抑制了谷氨酸脫所酶的活性,從而使GABA產量下降。

圖7　無機鹽對Lb-17產GABA的影響Fig.7　Effect of mineral salts on the production of

圖8　CaCl2和MgSO4對Lb-17產GABA的影響Fig.8　Effect of CaCl2 and MgSO4 on the production of GABA

2.6培養基成分響應曲面優化實驗

通過對單因素實驗的分析,以GABA產量為指標,對葡萄糖(g/L)、酵母粉(g/L)、Ca2+(mmol/L)、Mg2+(mmol/L)、L-谷氨酸鈉(g/L)五個因素設計響應面實驗。然后用多元回歸分析,擬合二次多項回歸模型的Box-Behnken設計,實驗結果見表2。

利用Design Expert 軟件對表2中的實驗數據進行多元回歸擬合,得到GABA產量對葡萄糖、酵母粉、Ca2+、Mg2+、L-谷氨酸鈉的二次多元回歸模型方程為:

GABA產量(g/L)=7.93+2.11A+0.77B-0.054C-0.28D-0.7E+0.19AB+0.50AC-0.35AD+0.35AE+0.42BC-0.25BD+1.56BE+0.17CD+2.17CE-0.9DE-2.46A2-1.80B2-2.40C2-2.20D2-1.14E2

對二次多元回歸方程進行顯著性驗證及方差分析,如表3。

表2　響應面實驗設計與結果

表3　回歸模型方程方差分析

2.7響應曲面分析

對發酵培養基中組分含量:葡萄糖(g/L)、酵母粉(g/L)、Ca2+(mmol/L)、Mg2+(mmol/L)、L-谷氨酸鈉(g/L)5個因素兩兩交互作用進行分析,做出相應的響應曲面,如圖9所示。通過等高線圖得到最優條件下各實驗因子的取值。等高線越密集且越趨向橢圓形表示兩因素交互作用顯著,反之則表示交互作用不顯著。圖9A～圖9G、圖9J交互作用顯著。圖9H中的各組因素兩兩交互作用的等高線則相對較圓,說明交互作用不顯著,該結果與表3的方差分析結果一致。

圖9　兩因素交互作用對GABA產量影響的分析圖Fig.9　Response surface showing theinteractive effects two factors on the production of GABA注:A:葡萄糖和Ca2+；B:葡萄糖和酵母粉；C:葡萄糖和Mg2+；D:葡萄糖和L-谷氨酸鈉；E:酵母粉和Ca2+；F:酵母粉和Mg2+；G:酵母粉和L-谷氨酸鈉;H:Ca2+和Mg2+;I:Ca2+和L-谷氨酸鈉;J:Mg2+和L-谷氨酸鈉。

根據回歸方程,用Design-Expert軟件做出響應曲面,考察擬合響應曲面的形狀。通過軟件優化,得到最優條件:葡萄糖12.82 g/L、酵母粉18.09 g/L、Ca2+54.12 mmol/L、Mg2+57.29 mmol/L、L-谷氨酸鈉26.99 g/L,GABA預測產量為8.55 g/L。

為實驗方便可行,將最優條件修正為:葡萄糖12.0 g/L、酵母粉18.0 g/L、Ca2+55.0 mmol/L、Mg2+60.0 mmol/L、L-谷氨酸鈉26.0 g/L。按最佳配比配制培養基,并在優化后的培養條件下進行培養,確定模型與實驗的相符性,得到GABA實際產量為8.037 g/L。實際發酵的產量與回歸方程接近,證明了模型的可靠性。

3　結論

通過單因素實驗分析了培養基對GABA產量的影響,并結合Box-Behnken的中心組合設計及響應曲面分析,建立了植物乳桿菌發酵條件的二次多項式模型,并經顯著性檢驗證明了該模型具有可靠性。最終得到植物乳桿菌Lb-17發酵產GABA的最佳條件:葡萄糖12.0 g/L、酵母粉18.0 g/L、Ca2+55.0 mmol/L、Mg2+60.0 mmol/L、L-谷氨酸鈉26.0 g/L。在此條件下,GABA的實際產量為8.037 g/L,與理論值(8.55 g/L)的相對誤差為5.61%,表明應用響應曲面法優化植物乳桿菌Lb-17產GABA的條件是可行的。優化后,植物乳桿菌Lb-17發酵γ-氨基丁酸產量達 8.037 g/L,比優化前5.49 g/L提高1.5倍。

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Optimization of fermentation conditions for the production ofγ-aminobutyric acid by Lactobacillus plantarum

YIN Ran,LIANG Jin-zhong*

(Key Laboratory of Food Science and Engineering,School of Food Engineering,Harbin University of Commerce,Harbin 150076,China)

Lactobacillus plantarum Lb-17 was fermented to produceγ-aminobutyric acid,using the production of GABA as a parameter.And then single factor test andresponse surface analysis were used to optimize the culture medium.The optimum medium constitution was as follows:glucose 12.0 g/L,yeast powder 18.0 g/L,Ca2+55.0 mmol/L,Mg2+60.0 mmol/L,L-Sodium glutamate 26.0 g/L.The yield ofγ-aminobutyric acid was 8.037 g/L after cultivated in optimized medium,which was 1.5 times that of the yield before.

γ-aminobutyric;fermentation conditions;optimization;Lactobacillus plantarum

2015-09-02

尹然(1990-)，女，碩士，研究方向：微生物學與發酵工程，E-mail：15244602089@163.com。

梁金鐘(1957-)，男，本科，教授，研究方向：微生物學與發酵工程，E-mail：Ljz2050@126.com。

黑龍江省高校科技創新團隊建設計劃項目(2010td04)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)07-0110-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.07.014