酸性蛋白酶基因Asp在紅曲霉中的同源表達及序列分析

邱思佳，霍丹群,*，侯長軍，唐玉明，于夢露，殷忠原，鄧　波，楊　平,

(1.重慶大學生物工程學院，重慶 400044；2.四川省瀘州市釀酒科學研究所，四川瀘州 646000；3.國家固態釀造工程技術研究中心瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州 646000)

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酸性蛋白酶基因Asp在紅曲霉中的同源表達及序列分析

邱思佳1，霍丹群1,*，侯長軍1，唐玉明2，于夢露1，殷忠原1，鄧波3，楊平1,3

(1.重慶大學生物工程學院，重慶 400044；2.四川省瀘州市釀酒科學研究所，四川瀘州 646000；3.國家固態釀造工程技術研究中心瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州 646000)

從紅曲霉基因組中擴增出酸性蛋白酶基因Asp的編碼區,構建其同源表達載體pBC-Hygro-Asp并導入到農桿菌GV3101備用。利用根癌農桿菌介導法將重組質粒導入紅曲霉,并篩選獲得Asp基因同源重組轉化子,實現了酸性蛋白酶基因在紅曲霉中的同源表達。轉化子中酸性蛋白酶基因表達量是野生型菌株的3.30倍,能達到高產酸性蛋白酶的目的。對紅曲霉酸性蛋白酶基因序列進行分析,結果顯示該基因產物有兩個天冬氨酸蛋白酶活性位點,為親水性分泌蛋白,不參與信號轉導,且與赤曲霉酸性蛋白酶有相同進化速率。

紅曲霉,酸性蛋白酶,同源表達,序列分析

紅曲霉(Monascus)是一種絲狀子囊菌,歸屬于真菌界子囊菌門真子囊菌綱散囊菌目紅曲科,以其酶系豐富、代謝產物多而被廣泛應用于各類產品的發酵生產[1]。部分紅曲霉菌株可產生大量活性較高的蛋白酶,可用于腌漬魚、肉、豆腐等高蛋白食品。

酸性蛋白酶也稱為天冬氨酸蛋白酶,是一種常用的蛋白水解酶。紅曲霉作為白酒發酵的重要菌株,其產生的酸性蛋白酶對于白酒產量和質量具有重要 的影響。在白酒釀造中提高酸性蛋白酶含量,可強化蛋白質的水解,豐富酒醅中氨基酸的含量,不僅有利于微生物的生長提高原料出酒率,且分解產生的氨基酸可作為生成白酒香味的前體物質[2]。但目前酸性蛋白酶酶制劑成本高、活性低,不能廣泛運用于生產[3]。

Asp基因能編碼產生分子量為41 ku的酸性蛋白酶[4]。本文通過PCR方法從紅曲霉基因組中擴增Asp基因,構建紅曲霉表達載體pBC-Hygro-Asp,再利用根癌農桿菌(Agrobacterium)介導法將Asp基因導入紅曲霉中,成功篩選出能高產酸性蛋白酶的紅曲霉同源轉化子菌株。該同源表達體系具有高效表達、準確加工、轉化子遺傳穩定的特點,可以在非選擇壓力下實現穩定傳代,為進一步在生產中應用奠定了基礎。目前還未見相關研究工作的報道。

1　材料和方法

1.1材料與儀器

釀酒紅曲霉四川省瀘州市釀酒科學研究所;質粒pBC-Hygro由法國P.Silar教授惠贈,該質?？傞L度為6.8 kb,啟動子和終止子分別為Neurospora crassa cpc-1和Aspergillus nidulanstrpC,;根癌農桿菌GV3101由本實驗室保存。

紅曲霉酸性蛋白酶基因片段引物由英濰捷基貿易公司合成;高保真酶Pfu DNA聚合酶、T4 連接酶、pMD-18T載體以及限制性內切酶Sma I購于Takara公司;真菌RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、質粒小提試劑盒OMEGA公司;氯霉素、潮霉素、頭孢噻污鈉、慶大霉素、其他常規分析純試劑以及LB培養基和察氏培養基北京康為世紀科技有限公司。

紅曲霉發酵培養基的配制:17.79 g麩皮,4.53 g豆粉餅,0.205 g KH2PO4,45 mL水,用0.1 mol/L鹽酸將培養基pH調至5,滅菌20 min。

酸性蛋白酶鑒定培養基的配制:酪素0.5 g,瓊脂2.5 g,加入到100 mL pH為3.5的乳酸-乳酸鈉緩沖液中[5]。

普通PCR儀170-9713Bio-rad公司,基礎電泳儀PowerpacBio-rad公司,恒溫培養振蕩器ZHWY-200D上海智城分析儀器制造有限公司,高速冷凍離心機X-22RBeckman公司,凝膠成像儀ChemiDoc MPBio-rad公司。

1.2實驗方法

1.2.1紅曲霉Asp基因的克隆根據GenBank中公布的紫紅曲霉酸性蛋白酶基因序列(AB090877.1)和紅曲霉表達載體pBC-Hygro多克隆位點的特征,設計Asp基因引物。引物序列:Asp-ORF-F:5′-TCCCCCGGGATGGTCGTCTTCAGCAAGATCAC-3′,Asp-ORF-R:5′-TCCCCCGGGTTATGCCTGAGG GGCAAATCCGA-3′。以紅曲霉cDNA為模板,用上述引物擴增得到長度為1200 bp左右的基因片段。將該片段連接到pMD-18T載體,轉入大腸桿菌(E.coli)DH5α,獲得的陽性克隆委托華大公司測序,測序后進行Blast比對分析。

1.2.2Asp基因紅曲霉同源載體的構建將包含有Sma I識別位點的Asp片段和載體pBC-Hygro分別用Sma I限制性內切酶進行酶切,使用膠回收試劑盒回收,純化酶切后的Asp片段和線性pBC-Hygro載體,然后使用T4連接酶將Asp片段連接到pBC-Hygro載體上。使用引物Asp-ORF-F和Asp-ORF-R篩選重組子,并將篩選出的重組子進行Sma I酶切,驗證酶切結果是否含Asp基因和線性質粒的兩條片段。如圖1所示。

圖1　表達載體pBC-Hygro-Asp的構建圖譜Fig.1　pBC-Hygro-Asp expression vector

1.2.3Asp基因在紅曲霉中的同源表達采用凍融法將重組質粒pBC-Hygro-Asp轉化到根癌農桿菌中。從YEB平板(含34 μg/mL氯霉素、50 μg/mL利福平)上挑取重組農桿菌擴培,取菌液進行PCR擴增以驗證重組載體是否已轉入農桿菌。在重組農桿菌菌液中加入200 μmol/mL的乙酰丁香酮溶液,200 r/min培養4 h。同時用含有0.05%聚山梨酯-80的0.85%生理鹽水洗脫固態培養的紅曲霉孢子。將誘導好的根癌農桿菌和紅曲霉孢子OD600值調至0.7,取等量誘導后的重組農桿菌與紅曲霉孢子涂布在共培養培養基中的玻璃紙上,33℃培養2 d。將玻璃紙揭下置于察氏培養基平板(含34 μg/mL氯霉素、20 μg/mL頭孢噻污鈉)上,33℃培養7 d。挑取玻璃紙上長出的紅曲霉單菌落轉移至麥芽瓊脂培養基(含100 μg/mL潮霉素)擴培,提取其基因組DNA,PCR檢驗潮霉素抗性基因hph序列,以驗證重組質粒是否轉入紅曲霉[6]。檢驗hph序列所用引物序列為:hph-F:5′-GCAAGACCTGAAAC-3′,hph-R:5′-CTCCATACAAGCCAACCAC-3′。

1.3Asp基因表達量和酸性蛋白酶表觀酶活的測定

參考GenBank:AJ417880.1設計紅曲霉酸性蛋白酶qPCR內參引物,其序列為:actin-F:5′-CCCAAGTCCAACAGGGAG-3′,actin-R:5′-CACAGAGTCAAGCACGATA-3′。制備紅曲霉野生型菌株和紅曲霉轉化子菌株的cDNA,以其為模板,對紅曲霉酸性蛋白酶基因進行qPCR反應。

將紅曲霉轉化子菌株和野生型菌株分別接種于發酵培養基,33℃培養120 h[7-8]。在酸性蛋白酶鑒定培養基平板上打孔,將野生型菌株和紅曲霉轉化子菌株的發酵液分別滴1 mL到孔內,置于35℃,保溫20 h,觀測水解圈直徑。

1.4紅曲霉Asp基因的序列分析

1.4.1紅曲霉酸性蛋白酶親疏水性、跨膜結構域、信號肽分析蛋白質折疊時會形成疏水內核和親水表面,同時在潛在跨膜區出現高疏水值區域。因此,通過親疏水性圖譜能反映其結構上的折疊情況。利用生物信息學工具:ProtScale、TMHMM server v 2.0、SignalP可分別實現對紅曲霉酸性蛋白酶親疏水性、跨膜結構域、信號肽的分析。

1.4.2紅曲霉酸性蛋白酶系統進化樹的構建和分子鐘假說檢驗利用軟件MEGA 5將紅曲霉酸性蛋白酶基因序列與赤曲霉、米曲霉、煙曲霉、黑曲霉等13種常用曲霉屬絲狀真菌的酸性蛋白酶基因序列進行聚類分析,構建出系統進化樹,可對這些物種的遺傳多樣性和親緣關系作出分析。同時根據系統進化樹的分支對紅曲霉酸性蛋白酶基因和赤曲霉酸性蛋白酶基因進行分子鐘假說檢驗。先假設紅曲霉與赤曲霉的酸性蛋白酶以相同速率進化,再根據P值判斷是否接受該假設,以此比對二者的進化速率[9]。

2　結果和分析

2.1紅曲霉Asp基因的克隆

以紅曲霉基因組為模板,用引物Asp-ORF-F和Asp-ORF-R進行PCR擴增,得到1200 bp左右的特異性條帶,如圖2所示。將所得序列測序后進行Blast比對,結果與GenBank AB090877.1序列相似度達100%,表明紅曲霉酸性蛋白酶基因被成功克隆。

圖2　紅曲霉酸性蛋白酶基因Fig.2　Asp gene fragment of Monascus注：M:2000 bp的 DNA Marker;1～4:Asp基因片段。

2.2同源表達載體的構建

將重組質粒用引物Asp-ORF-F和Asp-ORF-R進行PCR擴增,進行三次重復實驗,均得到1200 bp左右的特異性條帶,如圖3a。同時,用Sma I限制性內切酶對該重組質粒進行酶切,酶切結果顯示兩條帶,一條長度約為1200 bp,為Asp基因片段,另一條長度約為7000 bp,為pBC-Hygro線性質粒,如圖3b。以上兩個結果表明質粒pBC-Hygro-Asp構建成功。

圖3　重組表達質粒pBC-Hygro-Asp的構建Fig.3　Construction of pBC-Hygro-Asp recombinant plasm注：(a)M:2000 bp的DNA Marker;1～3:pBC-Hygro-Asp上的Asp基因片段；(b)M:8000 bp的DNA Marker;1:pBC-Hygro-Asp的酶切驗證結果。

2.3轉化子的鑒定和篩選

潮霉素磷酸轉移酶基因hph是重組質粒上的潮霉素抗性基因,野生型紅曲霉沒有該基因,故可用于轉化子的篩選。將經過轉化處理的菌株提取基因組后用hph序列驗證,擴增的目的產物長度為425 bp(圖4),結果表明pBC-Hygro-Asp重組質粒被成功轉入紅曲霉,實現了紅曲霉酸性蛋白酶菌株的同源轉化。

圖4　紅曲霉轉化子菌株的hph驗證Fig.4　hph gene verification of transformants注：1～2:野生型菌株；3～4:轉化子菌株。

2.4轉化子形態特征

從圖5可看出在含有潮霉素(100 μg/mL)的麥芽瓊脂培養基上接種的野生型紅曲霉33℃培養9 d后并未生長,而在相同條件下接種的紅曲霉轉化子菌株表現出生長能力。同時,研究發現,在含潮霉素和不含潮霉素的條件下,轉化菌株的表型產生一定的差異:在含潮霉素的培養基上,轉化子菌株生長速度較緩慢,菌絲呈現鮮艷的橘紅色,菌落邊緣不規則且菌絲體較少;而在不含潮霉素的培養基上,菌株生長速度較快,與野生型菌株相比菌落形態相似,但在菌落外圍出現了顏色更深的橘色圓圈。

圖5　紅曲霉菌株菌落形態Fig.5　The colonies of Monascus strain注：(a)野生型菌株,(b)轉化子菌株,(c)含潮霉素培養基上的野生型菌株,(d)含潮霉素培養基上的轉化子菌株。

原因可能是:紅曲霉是經聚酮途徑合成色素,轉化子相比于野生型菌株能產生更多酸性蛋白酶,從而分解更多的蛋白質為氨基酸,這部分具有前體作用的氨基酸能夠刺激紅曲霉更多色素的合成[10]。同時,分解產生的氨基酸也能為紅曲霉的生長提供更多的氮源。因此,導致紅曲霉轉化子菌株生長更旺盛,菌落顏色更鮮艷。

將紅曲霉轉化子進行傳代培養,根據各代轉化子總DNA中重組質粒pBC-Hygro-Asp上的hph片段以驗證重組質粒的遺傳穩定性。電泳結果表明,將轉化子紅曲霉傳至第四代,該重組質粒在紅曲霉中仍穩定表達,說明所構建的紅曲霉轉化子遺傳穩定性較好(圖6)。

圖6　紅曲霉轉化子遺傳穩定性驗證Fig.6　The hph genetic stability of transformant注：1:第一代轉化子菌株,2:第二代轉化子菌株,3:第三代轉化子菌株,4:第四代轉化子菌株。

2.5轉化子Asp基因表達量和表觀酶活的測定結果

測量酸性蛋白酶鑒定培養基上的水解圈外徑和水解孔內徑,算出實際水解的面積。結果表明,紅曲霉轉化子菌株和野生型菌株的等量發酵液在鑒別培養基上20 h內產生的水解面積均值比為2.04。同時,qPCR結果顯示,紅曲霉轉化子菌株的酸性蛋白酶基因表達量是其野生型菌株酸性蛋白酶基因表達量的3.30倍(圖7)。說明重組質粒轉入紅曲霉后,酸性蛋白酶基因表達量上調,轉化子菌株分解蛋白質的能力較野生型紅曲霉菌株顯著增強。因此,紅曲霉酸性蛋白酶基因的同源表達實現了其酸性蛋白酶高產菌株構建的目的。

圖7　紅曲霉酸性蛋白酶基因qPCR結果Fig.7　The qPCR result of Monascus Asp

2.6紅曲霉酸性蛋白酶基因序列分析結果

2.6.1紅曲霉酸性蛋白酶親疏水性、跨膜結構域、信號肽的分析結果根據紅曲霉酸性蛋白酶基因序列,分析可得紅曲霉酸性蛋白酶分子量為41.4 ku,從親疏水性序列譜可判斷目的序列的疏水性氨基酸分數最大值為2.056,最小值為-2.533,均值為-0.133,由此,可以認為紅曲霉酸性蛋白酶具有親水性。

跨膜受體是參與細胞與外界通信的特殊整合膜蛋白,在信號轉導中發揮著重要的作用。胞外信號分子附加到跨膜受體,從而引發了細胞的信號轉導。通過對紅曲霉酸性蛋白酶信號肽的預測可以確定該蛋白是否能跨膜轉移至特定亞細胞結構以及是否分泌到紅曲霉體外。跨膜蛋白一般以疏水的α-螺旋與膜脂肪發生非共價結合,在細胞中常執行信號傳導或轉運通道功能。利用TMHMM分析,表明紅曲霉酸性蛋白酶無跨膜螺旋區,即該蛋白不參與紅曲霉與外界的通信,不能引發紅曲霉的信號轉導[11]。

紅曲霉酸性蛋白酶信號肽分析結果表明最大C值出現在第21位氨基酸,為剪切位點。S-mean和D值作為區分分泌蛋白和非分泌蛋白的標準,非分泌蛋白計算值較低。研究結果揭示:紅曲霉酸性蛋白酶的S-mean值為0.542,D值為0.481。因此,紅曲霉酸性蛋白酶具有信號肽,它最可能的剪切位點在第20和21位點間,成熟蛋白啟動的位置是第21位點,且該蛋白為分泌型蛋白。

2.6.2紅曲霉酸性蛋白酶系統進化樹構建和分子鐘假說檢驗圖8為紅曲霉酸性蛋白酶基因進化樹。其結果表明紅曲霉與赤曲霉的親緣關系最為接近,其次是紅綬曲霉、米曲霉和黃曲霉,表明在這幾種曲霉中該拷貝酸性蛋白酶序列沒有發生快速變化。酸性蛋白酶家族共有模式為:[LIVMFGAC]-[LIVMTADN]-[LIVFSA]-D-[ST]-G-[STAV]-[STAPDENQ]-{GQ}-[LIVMFSNC]-{EGK}-[LIVMFGTA],其中D為氨基酸活性位點殘基。將紅曲霉酸性蛋白酶序列與家族序列比對,可知二者模式完全匹配。

此外,對紅曲霉和赤曲霉的進化速率進行了分子鐘假設的檢驗。假設紅曲霉與赤曲霉以相同速率進化,以最先進化的紅綬曲霉為外類群,發現三條序列共有位點為10個,卡方檢驗值為0.41(自由度為1,p=0.52),由于p值大于0.05,因此假設成立,紅曲霉和赤曲霉的酸性氨蛋白酶以相同速率進化。

圖8　紅曲霉酸性蛋白酶基因進化樹Fig.8　Phylogenetic tree of Monascus Asp

3　結論

本文通過紅曲霉酸性蛋白酶基因的同源表達,得到紅曲霉酸性蛋白酶的同源轉化子,表明利用紅曲霉孢子在根癌農桿菌介導下實現紅曲霉的同源轉化是可行的。獲得的重組轉化子的酸性蛋白酶基因表達量是野生型菌株的3.30倍,且經過傳代驗證仍具有該重組特性,遺傳穩定性較好。根據對紅曲霉酸性蛋白酶基因序列的分析,可得知紅曲霉酸性蛋白酶是一種分泌型的親水蛋白,不參與信號轉導,且與酸性蛋白酶家族序列完全匹配,沒有特異位點,并與赤曲霉的酸性蛋白酶有相同的進化速率。

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Homologous expression and sequence analysis of Monascus Asp gene

QIU Si-jia1,HUO Dan-qun1,*,HOU Chang-jun1,TANG Yu-ming2, YU Meng-lu1,YIN Zhong-yuan1,DENG Bo3,YANG Ping1,3

(1.College of Bioengineering,Chongqing University,Chongqing 400044,China； 2.Luzhou Liquor-making Science Research Institute,Luzhou 646000,China； 3.National Engineering Research Center of Solid-State Brewing, Luzhou Laojiao Group Co.Ltd.,Luzhou 646000,China)

In this work,the coding region of Asp was amplified by PCR from the genomic DNA of the Monascus and the homologous vector pBC-Hygro-Asp was constructed and then was introduced into the Agrobactium tumefaciens strain GV3101 for further study.The agrobacterial cells harboring the pBC-Hygro-Asp vector was introduced into the genome of Monascus via Agrobacterium tumefaciens-mediated method and the positive recombinant of Monascus was obtained.The expression level of acid protease gene in transformants strain was 3.30 times that of the wild Monascus,which indicated that the Monascus recombinant with high yield of acid protease was successfully achieved.The gene sequence of acid protease showed the gene had two aspartic proteases with active sites and the protease was a hydrophilic secretory protein without performance of signal transduction and keet the same evolution rate as that of Aspergillus ruber.

Monascus;acid protease;homologous expression;sequential analysis

2015-09-21

邱思佳(1990-),女,碩士研究生,研究方向:微生物分子生物學,E-mail:1990qsj@sina.com。

霍丹群(1965-),女,博士,教授,研究方向:微生物資源開發與利用、生物大分子的結構與功能,E-mail:huodq@cqu.edu.cn。

國家科技支撐計劃(2014BAD07B02);四川省科技支撐計劃(2010NZ0093);釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室項目(NJ2011-03,NJ2014-03);重慶大學大型儀器設備開放基金。

TS201.3

A

1002-0306(2016)07-0105-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.07.013