天鵝蛋中主要致腐微生物的分離與鑒定

智秀娟,郝艷芳,仝其根,伍　軍,杜　斌

(1.北京農學院 食品質量與安全北京實驗室,北京 102206;2.北京勤邦生物技術有限公司,北京 102206；3.蛋品安全與加工北京市工程研究中心,北京 102206)

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天鵝蛋中主要致腐微生物的分離與鑒定

智秀娟1,郝艷芳2,仝其根3,*,伍軍1,杜斌1

(1.北京農學院 食品質量與安全北京實驗室,北京 102206;2.北京勤邦生物技術有限公司,北京 102206；3.蛋品安全與加工北京市工程研究中心,北京 102206)

在貯藏期間,天鵝蛋容易被環境微生物通過蛋殼表面的氣孔侵染而腐敗,大大降低其市場價值。該研究從腐敗天鵝蛋中分離得到5株細菌,對其進行形態、生理生化特性研究,并結合16s rRNA基因序列分析和系統發育樹分析,最終分別鑒定為氧化節桿菌(Arthrobacter oxydansi)、成團泛菌(Pantoea agglomerans)、麥氏弧菌(Vibrio metschnikovii)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)和糞產堿桿菌(Alcaligenes faecalis)。本研究為天鵝蛋的抗菌防腐貯藏提供了參考。

天鵝蛋,腐敗微生物,分離,鑒定

我國禽蛋產量居世界首位[1]。天鵝蛋屬珍稀類禽蛋,營養價值和市場價值高,微生物侵染后導致腐敗變質,嚴重影響天鵝蛋的銷售和深加工,給生產企業帶來的損失較大。天鵝可通過馴化雜交后人工規模化養殖。由于禽蛋特有的產出方式,其表面易附著禽類糞便、飼料粉塵、血跡等而感染微生物,并且在運輸和貯藏過程中也會有感染容器和人手上微生物的風險[2-4]。隨著時間推移,蛋內溶菌酶活性下降,微生物通過蛋殼表面氣孔進入蛋內,一旦大量繁殖,會引起禽蛋腐敗變質[5]。目前國內對導致雞蛋腐敗變質微生物的研究較深入,雞蛋中常見的腐敗菌主要有微球菌屬(Micrococcus)、假單胞菌(Pseudonomas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)等,霉菌有曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、毛霉屬(Mucor)等[6],然而對天鵝蛋中腐敗微生物的研究鮮有報道。

近年來,分子生物學方法已廣泛用于細菌分類和鑒定。細菌16s rRNA基因序列極具保守性又具高變性,其保守性能夠很好地反映物種間的親緣關系,而高變區則因細菌種類不同而異,是屬種鑒定的分子基礎[7]。本實驗從腐敗變質天鵝蛋中分離純化得到主要微生物,通過形態學、生理生化和16s rRNA基因序列分析,對腐敗微生物進行鑒定。本研究為今后天鵝蛋的抗菌貯藏保鮮提供參考依據。

表1　腐敗天鵝蛋中細菌的菌落和細胞顯微鏡形態

注:G+:革蘭氏陽性菌,G-:革蘭氏陰性菌。1材料與方法

1.1材料與儀器

營養瓊脂培養基,腦心浸出液肉湯(BHI),馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA)廣州環凱生物技術有限公司。

革蘭氏染色液廣州環凱生物技術有限公司;Taq dNA聚合酶,dNTPs,SYBR Green 1北京全式金生物技術有限公司;瓊脂糖基因科技(上海)有限公司;100 bp dNA Ladder大連寶生物工程有限公司,引物合成于上海生工生物技術有限公司,其他均為常規試劑。

DHP電熱恒溫恒濕培養箱上海慧泰儀器制造有限公司;Veriti 96孔熱循環儀美國應用生物系統(ABI)公司;Imaging G3全自動凝膠成像分析系統北京昊諾斯科技有限公司等。

1.2實驗方法

1.2.1腐敗微生物的分離、純化天鵝蛋,產于北京昊屹畜牧有限公司美洲黑天鵝與新疆博斯騰湖天鵝雜交的第2代天鵝,非種蛋,于4℃麩皮埋藏儲存3個月。CK組5枚正常天鵝蛋,燈檢,蛋殼內容物半透明;腐敗1組5枚天鵝蛋,燈檢,蛋殼內容物呈明顯灰綠色;腐敗2組5枚腐敗天鵝蛋,外觀正常,燈檢正常,100℃煮沸處理15 min,于常溫放置7d,光照蛋殼內有明顯黑斑。

將CK組、腐敗1組和腐敗2組的天鵝蛋樣品表面用75%酒精擦洗一遍,用滅菌生理鹽水將每組的5枚天鵝蛋內容物混合物制成1∶10倍梯度稀釋液,選擇合適稀釋度分別涂布于營養瓊脂平板,于37℃恒溫培養箱內培養48 h,挑取不同形態單菌落分別進行劃線純培養,連續劃線培養3代得到純化細菌[8]。

1.2.2腐敗微生物的鑒定

1.2.2.1形態學觀察將純化后細菌劃線接種于營養瓊脂斜面,37℃恒溫培養24～48 h,觀察記錄單菌落特點,并對其進行革蘭氏染色,干燥后于油鏡下觀察其菌體形態。

1.2.2.2生理生化特性根據形態觀察結果,結合天鵝蛋營養物質成分,參考《伯杰氏細菌鑒定手冊》[9]和《常見細菌系統鑒定手冊》[10]對菌株進行糖發酵實驗、甲基紅(M.R.)實驗、吲哚實驗、淀粉水解實驗、氧化酶實驗等生化實驗。

1.2.2.316s rRNA序列分析基因組DNA提取:將純化得到細菌接種到BHI培養液中,于37℃恒溫培養箱內培養24 h,采用煮沸法于沸水浴中裂解10 min,提取細菌基因組DNA[11]。

PCR擴增:鑒定細菌選用擴增引物為16S rRNA鑒定通用引物:27F和1492R,引物序列如下:27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;1492R:5′-GG TTACCTTGTTACGACTT-3′,該引物擴增目的片段約1500 bp。PCR反應條件如下:95℃預變性5 min,95℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s;34個循環,最后72℃保持5 min。反應結束后于4℃貯存。PCR擴增體系總體積為25 μL,反應體系中含1×PCR Buffer(Mg2+Plus),dNTP(0.2 mmol/L),上游引物(10 pmol/μL),下游引物(10 pmol/μL)Taq DNA聚合酶(2.5 U),DNA模板1 μL,其他為滅菌去離子水。

擴增產物的檢測:擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析,在凝膠成像系統中成像觀察。將PCR產物送至上海生工生物技術有限公司測序。

GenBank序列比對:將測序結果提交到NCBI(National Center of Biotechnology Information,美國國家生物技術信息中心)的GeneBank數據庫中進行同源性比對(Blast),找出同源性最高的模式菌株,并獲取菌株收錄號。

1.2.2.4系統發育樹構建在GenBank數據庫中選取同源性較近16s rRNA基因序列,采用MEGA 5.0軟件,進行多序列比對,鄰位連接法進行1000次的相似度重復計算,構建腐敗菌與同源性菌株的系統發育樹。

2　結果與分析

2.1腐敗菌的分離純化及形態觀察

通過平板分離和劃線純化,從正常天鵝蛋中未分離到細菌;腐敗天鵝蛋1組中分離得到3株細菌分別命名為B1-1、B1-2、B1-3,從腐敗天鵝蛋2組分離得到2株細菌,命名為B2-1、B2-2。分離腐敗菌的菌落形態和細胞形態見表1、圖1。

圖1　腐敗菌在顯微鏡下的細胞形態Fig.1　The cell morphology of spoilage bacteria in the microscope注:圖形左上編號B1-1、B1-2、B1-3、B2-1、B2-2為腐敗菌菌株命名號。

2.2生理生化特征

根據細菌鑒定原則,對分離純化的5株腐敗菌進行生理生化鑒定實驗,其特征反應鑒定結果見表2。結合形態學和生理生化實驗,參考《常見細菌系統鑒定手冊》,菌株B1-1為兼性厭氧發酵型革蘭氏陰性桿菌,其細胞形態為彎桿菌,屬弧菌科,氧化酶陰性的弧菌科有麥氏弧菌和產氣弧菌,V-P反應陽性可初步鑒定其為麥氏弧菌。菌株B1-2為兼性厭氧發酵型革蘭氏陽性球菌,接觸酶陰性,氧化酶陽性,細胞形態無四聯和長鏈排列,發酵葡萄糖不產氣,發酵乳糖,精氨酸脫羧酶陽性,水解精氨酸產氨,初步鑒定為腸球菌屬。菌株B1-3為好氧非發酵型革蘭氏陰性桿菌,動力生長,氧化酶、接觸酶陽性,不水解明膠、淀粉,不利用糖類,該菌生化反應較弱,有待進一步鑒定。菌株B2-1為好氧發酵型革蘭氏陽性桿菌,接觸酶陽性,氧化酶陰性,發酵糖類,其細胞形態有桿球變化趨勢。菌株B2-2為兼性厭氧發酵型革蘭氏陰性桿菌,動力生長,產黃色素,氧化酶陰性,接觸酶陽性,吲哚陰性,MR陽性,發酵糖類,賴氨酸、鳥氨酸及精氨酸脫羧酶皆陰性,初步鑒定其為腸桿菌科泛菌屬。

表2　腐敗菌的生理生化特性

注:“+”表示為陽性,“-”表示為陰性,“ND”表示未檢測。

2.316s rRNA基因序列分析

2.3.1PCR產物電泳圖對腐敗菌的PCR產物進行凝膠電泳檢測,結果如圖2所示。由圖可見,腐敗細菌的16s rRNA基因序列擴增產物的條帶明顯,長度約為1500 bp左右,與預期結果相符,且陰性對照組無條帶,表明擴增實驗成功,PCR體系無污染。

2.3.2序列比對分析將PCR產物委托上海生工生物有限公司測序,將測定結果交到NCBI的GenBank數據庫進行Blast比對,序列比對鑒定結果見表3,5株細菌與NCBI上登記菌株的同源性均達到99%以上。因此,菌B1-1被初步鑒定為麥氏弧菌,菌B1-2為屎腸球菌,菌B1-3為糞產堿桿菌,菌B2-1為氧化節桿菌,菌B2-2為成團泛菌。

2.4系統發育樹的構建

選取GeneBank數據庫中與腐敗菌同源性較高的24株登記菌株的16s rRNA基因序列作為參比序列,采用MEGA 5.0軟件,進行多序列比對,鄰位連接法進行1000次的相似度重復計算,構建系統發育樹(圖3)。菌株B1-1與所鑒定的5株細菌在系統發育樹上的種屬關系與序列比對結果(表3)相符,即鑒定結果一致。

通過16s rRNA基因序列和系統發育樹分析,5株腐敗菌的鑒定結果與菌株形態學和生理生化實驗特征基本一致,可將腐敗菌B1-1鑒定為麥氏弧菌(Vibrio metschnikovii),菌B1-2為屎腸球菌(Enterococcus faecium),菌B1-3為糞產堿桿菌(Alcaligenes faecalis),菌B2-1為氧化節桿菌(Arthrobacter oxydansi),菌B2-2為成團泛菌(Pantoea agglomerans)。

表3　菌株收錄號、同源性比較及種屬鑒定

圖3　基于菌株16s rRNA基因序列同源性的系統發育樹Fig.3　The phylogenetic tree of strains based on 16s rRNA sequenceses注:Genebank菌株收錄號備注于細菌種屬名稱后;0.02為系統發育樹進化距離;發育樹分支前數值為1000次相似度重復計算的步長值。

3　討論和結論

本研究從腐敗天鵝蛋中分離得到5株細菌,利用形態學觀察和生理生化特性研究,并結合16s rRNA基因序列分析和系統進化樹分析對腐敗微生物進行鑒定分析,5株細菌分別鑒定為氧化節桿菌(Arthrobacter oxydansi)、成團泛菌(Pantoea agglomerans)、麥氏弧菌(Vibrio metschnikovii)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)和糞產堿桿菌(Alcaligenes faecalis)。

實驗中對正常的生鮮天鵝蛋進行微生物分離時未分離得到細菌,說明該批次天鵝蛋未受微生物侵染或其自身含有部分抑菌物質如溶菌酶,從而抑制微生物的生長[12]。而從腐敗天鵝蛋中分離得到麥氏弧菌、屎腸球菌和糞產堿桿菌,說明這幾種微生物很可能是導致天鵝蛋腐敗的原因。研究結果表明,麥氏弧菌是公認的13種致病性弧菌當中的一種[13],主要引起腹瀉、創傷性感染和敗血癥[14],亦能引起雞弧菌病,會污染食品和飲用水。腐敗天鵝蛋分離到的麥氏弧菌可能來源為帶菌鵝體或養殖環境的污染。屎腸球菌和糞產堿桿菌則是寄生于動物腸腔內的常見菌,此兩種菌侵染天鵝蛋可能途徑為蛋表面附著的飼料粉塵或天鵝糞便。

從腐敗熟天鵝蛋中分離到氧化節桿菌和成團泛菌。天鵝蛋熟制過程可以很大程度殺滅并未大量擴增的微生物,但同時也會導致蛋清中的溶菌酶失活,使得煮熟后天鵝蛋容易受到放置環境中微生物的侵襲。這可能是導致實驗中的生熟天鵝蛋檢出菌并不一致的原因。從腐敗的熟制天鵝蛋中分離得到的氧化節桿菌和成團泛菌廣泛存在于環境中[15],說明高溫加熱處理可以滅活導致天鵝蛋腐敗的細菌,但是熟制后的儲藏環境和外界條件亦會導致蛋品的“二次污染”。

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Isolation and identification of spoilage microorganisms from the swan eggs

ZHI Xiu-juan1,HAO Yan-fang2,TONG Qi-gen3,*,WU Jun1,DU Bin1

(1.Beijing University of Agriculture,Beijing 102206,China; 2.Beijing Kwinbon biotechnology co.,LTD.Beijing 102206,China； 3.Beijing Engineering Research Center of Egg Safety Production and Processing,Beijing 102206,China)

Due to the surrounding microorganisms entrance though surface pores,the swan eggs were easily rotted during the storage period,which seriously decrease its market value.In this study,five bacterial strains were isolated from the rotted swan eggs,which were identified as Arthrobacter oxydansi,Pantoea agglomerans,Vibrio metschnikovii,Enterococcus faecium and Alcaligenes faecalis by the study of the morphological and physiochemical characteristics combining with the 16S rRNA sequence and phylogenetic analysis.The study could provide reference for the antimicrobial and antiseptic storage of the swan eggs.

swan egg;spoilage microorganisms;isolation;identification

2015-10-16

智秀娟(1975-)，女，博士，講師，研究方向：農產品加工與貯藏、食品包裝，E-mail:38534891@qq.com。

仝其根(1962-)，男，碩士，教授，研究方向：蛋品、食品添加劑、農產品加工等，E-mail:tongqigen@163.com。

北京市農委項目(2013010101)；北京市教委面上項目(KM2015100220013)；北京市高校青年英才項目(YETP1721)；北京農學院優秀青年教師培育項目。

TS253.4

A

1002-0306(2016)07-0101-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.07.012