杜香多糖的單糖組分分析及其理化性質研究

張喬會,逄錦慧,田盼盼,王建中,羅興武,*

(1.湖北民族學院科技學院,湖北恩施 445000;2.北京林業大學林業食品加工與安全北京市重點實驗室,北京 100083)

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杜香多糖的單糖組分分析及其理化性質研究

張喬會1,2,逄錦慧2,田盼盼1,王建中2,羅興武1,*

(1.湖北民族學院科技學院,湖北恩施 445000;2.北京林業大學林業食品加工與安全北京市重點實驗室,北京 100083)

為分析杜香多糖的單糖組成、酶抑制作用及抗氧化性能,采用高效陰離子色譜法、PNPG法及ABTS法對杜香多糖樣品進行了分析檢測。檢測得到杜香多糖含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖幾種單糖組分;其對α-葡萄糖苷酶的抑制與濃度呈正相關,在3 mg/mL時,抑制率達30%;清除ABTS自由基的EC50為2.25 mg/mL。杜香多糖含有豐富的單糖組成,具有較好的α-葡萄糖苷酶抑制和體外抗氧化活性。

杜香,多糖,單糖組分,抗氧化,α-葡萄糖苷酶抑制

杜香(Ledum palustre L.)為杜香屬的常綠灌木[1],是我國東北主要森林組成樹種,其分布面積約占大興安嶺林地面積的70%[2]。據資料顯示,大興安嶺杜香干葉年生產量可達536925 t[3]。杜香含有多種揮發性成分[4]、萜類[5]、熊果酸[6]、多糖[7]等成分。

多糖的單糖組成分析是其性質、結構及構效關系研究的一項基本且重要的內容,可以對多糖的研究利用提供直接的依據。目前對多糖的單糖組分分析主要采用糖腈乙酸酯衍生化[8-9]、糖醇乙酸酯化[10]、糖醇三氟乙酸化[11]、PMP衍生化[12-15]、硅烷衍生化[16]、甲基化后利用液相色譜[17-18]、氣相色譜[19-20]、質譜[21]等及陰離子色譜圖法[22-23]等進行檢測分析。本文采用高效陰離子色譜法(HPAEC)分析多糖的單糖組成,操作簡便,檢測限低,且準確度和精密度均較高,不需要進行衍生化,可以達到簡便、高效、準確地分析多糖的單糖組成等目的。學者對杜香進行了較多的研究,但都集中在杜香精油上,對杜香多糖研究較少,張喬會等對多糖提取做了初步研究[7],對其性質等幾乎沒有研究。隨著天然產物研究的不段深入,杜香資源開發潛力巨大,研究杜香多糖的組分及其理化性質等可為杜香的綜合開發利用提供理論依據,從而促進其開發。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

表1　α-葡萄糖苷酶抑制率檢測反應體系的組成

杜香內蒙古金河林業局提供，北京林業大學植物專家鑒定,自然風干,磨粉,過40目篩,備用。

磷酸氫二鈉,磷酸二氫鈉,氯化鈉,氫氧化鈉,98%濃硫酸,去離子水,超純水,單糖標準品(鼠李糖,阿拉伯糖,木糖,甘露糖,葡萄糖,半乳糖)純度≥99%,Sigma;α-葡萄糖苷酶,4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷PNPG,純度≥99%,Sigma;2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽。

KQ-500E型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司;QI-901渦旋混合器海門市其林貝爾儀器制造有限公司;臺式離心機上海安亭科學儀器廠;RE-5203旋轉蒸發儀上海亞榮生化儀器廠;METTLER TOLEDO 電子天平梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;Thermo Heto Power Dry LL1500 Freeze Dryer美國Thermo Fisher Scientific公司;S-3400N掃描電子顯微鏡日本日立公司;E-1010濺射鍍膜機日本日立公司;Model 680 Microplate reader 酶標儀:BIO-RAD;HHS4型恒溫水浴鍋上海浦東躍新科學儀器廠;PHS-25型pH計上海精密科學儀器有限公司;ICS-3000雙系統離子色譜儀(包括AS50自動進樣器)美國戴安公司;MILLI-Q Advantage A10超純水機美國密理博公司。

1.2實驗方法

1.2.1杜香水溶性多糖的提取純化采用水提醇沉法[7]。準確稱取一定量的杜香枝葉粉,按1∶35(m/v)加入去離子水,然后放入恒溫水浴震蕩箱中80℃震蕩6 h,離心分離液體和固體粉末,向上清液中加入無水乙醇至上清液體系中乙醇濃度為85%,放置于4℃冰箱中靜置1 h后分離固液兩相,固體反復溶解后加醇沉淀,用 Sevage法去除樣品中的蛋白質,即用氯仿∶戊醇或丁醇4∶1比例混合,加到樣品中振搖,使樣品中的蛋白質變性成不溶狀態,離心除去,所得樣品在-110℃真空冷凍干燥,便可得到杜香多糖成品。

1.2.2杜香多糖紅外及紫外檢測將多糖樣品配成100 μg/mL的溶液,利用紫外光譜儀在200～400 nm波長下進行掃描;將得到的樣品粉末放入紅外光譜儀中,在400～4000 cm-1波數范圍,按分辨率為2 cm-1對其進行測定。

1.2.3杜香粗多糖的水解多糖的水解按Ling Yan Meng方法[24]。稱取樣品4～6 mg放于小瓶中,加入0.125 mL 72%的硫酸溶液和1.35 mL超純水后放置于烘箱中105℃反應2.5 h,其間每30 min搖晃一次,反應結束后對反應后的液體進行過濾(0.45 μm),取少量過濾液體稀釋50倍,備用。

1.2.4標準混合單糖液的制備分別稱取一定量的鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖等單糖配制成混合單糖標準液備用。

1.2.5離子色譜分析取水解完成并稀釋后的樣品及標準品用高效陰離子色譜儀進行檢測分析。檢測條件如下:色譜柱:Dionex CarboPacTMPA20分析柱(4 mm×250 mm),CarboPacTMPA20保護柱(3 mm×30 mm);檢測器:脈沖安培檢測器;流速:0.5 mL/min;檢測溫度:30℃;進樣體積:25 μL。

1.2.6α-葡萄糖苷酶抑制率的測定采用分光光度法進行測定[25],以PNPG為底物,通過α-葡萄糖苷酶酶解反應會釋放出硝基苯酚,在400 nm處有最大吸光度,可以根據這一特性測定樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

配制0.5 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH6.7)、25 mg/mL的α-葡萄糖苷酶溶液和0.9133 mg/mL的PNPG,在96孔酶標板每個小孔中依次加入緩沖液、樣品溶液、PNPG和酶溶液,混勻后在37℃條件下反應1 h,然后加入50 μL碳酸鈉溶液(0.67 mol/L)終止反應,在400 nm下用酶標儀測定吸光度值。測定反應體系如表1所示。

抑制率計算公式為:

酶抑制率活性(%)=[A空白-(A樣品-A樣品對照)]/A空白×100

1.2.7杜香水溶性多糖的SEM分析在掃描電子顯微鏡(SEM)設備下觀察冷凍干燥后的杜香水溶性多糖的表面形態,掃描電鏡采用10千伏的加速電壓,檢測前,使用濺射鍍膜機對材料表面進行噴金。

1.2.8杜香多糖對ABTS自由基清除率的測定杜香多糖對ABTS自由基清除率的測定參照Chen Dan-jun[26]和黎云龍[27]等的方法進行,即先制備形成ABTS自由基儲備液。然后按1∶50的比例用蒸餾水稀釋為在30℃、734 nm波長處的吸光度為0.7±0.02的ABTS工作液。

樣品管中加入200 μL不同濃度的杜香多糖樣品液和3 mL ABTS工作液;空白管用蒸餾水代替杜香多糖溶液;對照管用蒸餾水代替ABTS工作液;以上三組在室溫條件下避光放置1 h后,于波長734 nm處測定其吸光度(A)。

1.2.9數據處理采用Microsoft Excel(Office 2007)軟件整理數據,Orgin軟件進行統計分析。

2　結果與分析

2.1杜香多糖的紫外及紅外檢測結果

由圖1可以看出,樣品在200～400 nm波長范圍內沒有特征吸收峰;由圖2可見,紅外譜圖在杜香多糖紅外譜圖在3389、2889、1156～1024、1024 cm-1的尖峰以及1648、1567～1370、903 cm-1等處具有強弱不同的吸收峰,在3389 cm-1和1156～1024 cm-1的峰分別為O-H和C-O的伸縮振動,2889 cm-1的尖峰以及1567～1370 cm-1的不太尖的峰分別為C-H的伸縮振動和變角振動,1024 cm-1的較強吸收也說明了杜香多糖中可能有葡萄糖結構,1648 cm-1處出現吸收峰,推測該峰為醛基中C=O的伸縮振動引起的,在903 cm-1波數處還出現吸收峰,說明其可能含有β-型糖苷鍵。樣品的紫外和紅外檢測檢測結果符合多糖的光譜吸收特征[28],說明樣品為多糖。

圖1　杜香多糖紫外掃描光譜Fig.1　UV scanning spectrum of polysaccharide from Ledum

圖2　杜香多糖的紅外光譜圖Fig.2　IR spectrum of polysaccharide from Ledum

2.2杜香水溶性多糖的電鏡掃描分析

從以上電鏡掃描圖可以看出,冷凍干燥后的杜香水溶性多糖沒有固定的形態,由于冷凍干燥的原因,整體結構類似海綿。符合多糖沒有固定形態的物理特征。

圖3　杜香多糖的掃描電鏡圖Fig.3　Scanning Picture of Ledum polysaccharide by SEM

2.3杜香多糖單糖組成分析結果

單糖混合標準液的離子色譜圖見圖4,通過對離子色譜工作站提供的圖譜解析和單糖標準品混合樣品的離子色譜圖及離子色譜解數據的分析可知,從第一個峰到最后一個峰依次為鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖。

圖4　標準混合單糖離子色譜圖Fig.4　Ion chromatogram of standard mixed monosaccharides

杜香多糖的單糖組分組成從圖5分析,經過標準品離子色譜圖比對,確定了杜香多糖的單糖組成由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖等單糖組成,且根據峰面積比較可知,葡萄糖及半乳糖成分含量相對較高。

圖5　杜香多糖的離子色譜圖Fig.5　Ion chromatogram of Ledum polysaccharide注:1:鼠李糖;2 阿拉伯糖;3半乳糖;4:葡萄糖;5:木糖;6:甘露糖。

2.4α-葡萄糖苷酶抑制率的測定結果

杜香多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率影響如圖6所示。隨著多糖液濃度的提高,抑制活性逐漸升高。根據抑制劑與抑制率曲線圖可以看出,抑制劑濃度與抑制率基本呈現正相關關系,抑制率受濃度的影響明顯,杜香多糖濃度增大,其對α-葡萄糖苷酶的抑制率升高。且當杜香多糖液濃度為3 mg/mL時,抑制率便達30%,相比于張淑鵬等提取的昆侖雪菊提取物具有較好的抑制效果[29]。

圖6　杜香多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.6　Anti-α-glucosidase activity of Ledum polysaccharide

2.5杜香多糖的ABTS自由基清除結果

由圖7可知:隨濃度升高,杜香多糖和VC對ABTS自由基的清除率呈遞增趨勢,濃度越高,其清除效果越好,呈量效關系;當濃度為2.0 mg/mL時,杜香多糖的清除率為46.7%。由圖可知,VC及樣品對ABTS自由基的清除率在20%～60%間與濃度呈直線關系,可分別擬合成出一個一元一次方程,利用方程計算出杜香多糖及VC對ABTS自由基的EC50值分別為2.25 mg/mL和0.46 mg/mL。說明杜香多糖具有較好的抗氧化效果。

圖7　杜香多糖與VC清除ABTS+能力的比較Fig.7　The scavenging rate of ABTS radical on polysaccharide from Ledum compared with VC

3　結果與討論

本文利用水提醇沉法提取多糖,利用紫外及紅外方法對其進行鑒定,利用電鏡掃描進行表觀鑒定,證明其含有多糖的典型基團,在200～400 nm范圍內沒有特征吸收峰,SEM下沒有固定形態。利用高效陰離子色譜法對杜香總多糖水解后的單糖進行了組分分析,得到杜香總多糖含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖等單糖組分。采用PNPG法對杜香總多糖的α-葡萄糖苷酶抑制進行了分析測定,發現杜香多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制與濃度呈正相關,抑制率受濃度的影響明顯,杜香多糖濃度增大,其對α-葡萄糖苷酶的抑制率升高。且當杜香多糖液濃度為3 mg/mL時,抑制率便達30%,抑制效果較好。測定了其清除ABTS自由基的能力,其EC50值為2.25 mg/mL。分析單糖成分及其組成比例可為進一步純化鑒定多糖結果提供基礎依據,也可以為其開發利用提供一定方向。杜香多糖具有較好的抗氧化及α-葡萄糖苷酶抑制效果,可以將杜香多糖開發成具有輔助降血糖功能的保健食品等。

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Characterization of the monosaccharide composition and physical and chemical properties of Ledum polysaccharides

ZHANG Qiao-hui1,2,PANG Jin-hui2,TIAN Pan-pan1,WANG Jian-zhong2,LUO Xing-wu1,*

(1.Science and Technology College of Hubei University for Nationalities,Enshi 445000; 2.Beijing Key Laboratory of Forest Food Processing and Safety,Beijing Forestry University,Beijing 100083)

The monosaccharide compositions,enzyme inhibition and antioxidant properties of Ledum polysaccharides were analyzed by the high performance anion exchange chromatography,PNPG and ABTS method.The anion exchange chromatography results showed that main composition of Ledum polysaccharide were rhamnose,arabinose,xylose,mannose,glucose and galactose.The inhibitory activity ofα-glucosidase effect was positively correlated with concentration,and the inhibition rate was 30%,when the concentration was 3 mg/mL.The EC50of scavenging effect of ABTS radical was 2.25 mg/mL.It contains abundant monosaccharide components and possessed excellent inhibitory activity ofα-glucosidase and antioxidant activity.

Ledum;polysaccharide;monosaccharide composition;antioxidant;inhibition of glucosidase

2015-08-27

張喬會(1986-)，男，碩士，助教，研究方向：天然產物提取利用，E-mail：qiaohui.86@163.com。

羅興武(1978-)，男，碩士，副教授，研究方向：食品機械及天然產物提取，E-mail：lxwmss@163.com。

湖北民族學院科技學院自科課題(KJZ201604)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)07-0071-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.07.006