轉化生長因子-β1與表皮生長因子在成人增生性瘢痕中的表達及意義

黃克華，周國富,陳朗

(1.重慶市渝北區人民醫院燒傷整形科，重慶　401120；2.川北醫學院附屬醫院燒傷整形科，四川 南充　637000)

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轉化生長因子-β1與表皮生長因子在成人增生性瘢痕中的表達及意義

黃克華1，周國富2,陳朗2

(1.重慶市渝北區人民醫院燒傷整形科，重慶401120；2.川北醫學院附屬醫院燒傷整形科，四川 南充637000)

目的：初步探討轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)在成人增生性瘢痕發生中可能的作用，為臨床防治提供一定的依據。方法：通過SP法定性和ELISA法定量檢測TGF-β1和EGF在成人增生性瘢痕和成人正常皮膚中的表達情況。結果：TGF-β1、EGF在成人增生性瘢痕中呈高表達，二者在成人增生性瘢痕中表達水平呈正相關。結論：TGF-β1、EGF在成人增生性瘢痕中均呈高表達，TGF-β1和EGF在成人增生性瘢痕中的表達水平呈正相關，這為研究臨床預防、治療皮膚增生性瘢痕提供新思路。

成人增生性瘢痕；表皮生長因子；轉化生長因子-β1

【Abstract】Objective：To investigate transforming growth factor-β1(TGF-β1)and epidermal growth facto (EGF)in adults hypertrophic scars occurred in possible role,to provide basis for clinical prevention.Methods：The expression of TGF-β1 and EGF in adult hypertrophic scar and adult normal skin was quantitatively detected by SP and ELISA methods.Results：TGF-β1,EGF in adults hypertrophic scars showed high expression,both expressed in adult hyperplastic scar levels were positively correlated.Conclusion：TGF-β1,EGF in adults hypertrophic scars showed high expression,TGF-β1 and EGF expression levels in adult hypertrophic scars were positively correlated,which provide new ideas for clinical prevention and treatment of skin hypertrophic scars.

人皮膚增生性瘢痕(hypertrophical scar,HS)是當其受到創傷后在其修復過程中以膠原為主的細胞外基質(extracellular matrix,ECM)成分產生與沉積過多為特征的纖維代謝性疾病[1]，HS發病率4%～16%[2]。HS形成有眾多細胞生長因子參與，包括轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)等，其中TGF-β1是參與瘢痕形成的最具有代表性的細胞因子(cytokine,CK)之一[3]。EGF與表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)結合后加強TGF-β在膠原形成中的作用。目前，有關TGF-β1和EGF在成人HS中的表達是否有相關性的研究較少，本實驗用定性、定量分析成人正常皮膚組織和成人HS組織中二者的表達情況，初步探討二者在成人HS發生機制中有無相關性，為臨床防治HS提供一定幫助。

1　材料與方法

1.1組織標本

標本源于醫院手術患者，為2014年3月至2014年8月手術切口HS和燒傷后HS，瘢痕病程12～30個月，瘢痕無感染、藥物注射及放療史，無免疫相關疾病及全身免疫治療，身體其他部位無腫瘤；對照標本為成人正常包皮(表1)。

表1　臨床組織標本資料

*P<0.05，正常皮膚與HS患者年齡比較；#P>0.05，HS中男性與女性患者年齡比較；△P>0.05，男性與女性患者中HS年齡比較。

1.2主要試劑和儀器

Abcam公司的Anti-TGFbeta1、Anti-EGF；福建邁新公司的濃縮型DAB試劑盒等；上海恒生科技生物有限公司的ELISA檢測試劑盒(EGF、TGF-β1)。OLYMPUS熒光顯微鏡、電子照相機裝置(日本)，臺式高速冷凍離心機-0110105025 ZH(上海力申儀器有限公司)。

1.3實驗方法

1.3.1石蠟切片免疫組織化學法(SP法)標本用4%中性多聚甲醛固定，石蠟包埋制成厚度2.5 μm連續切片，依次常規脫蠟水化，酒精梯度脫水，3%過氧化氫溶液封閉內源性過氧化物酶，PBS液洗切片，微波爐中修復，PBS液沖洗，滴加第一抗體，孵育，PBS液中蕩洗，滴加二抗中的A液、B液，再孵育，再置入PBS液中輕蕩洗，顯色，沖洗，終止顯色，蘇木素復染，返藍，脫水，透明，封片，晾干。

1.3.2酶聯免疫吸附測定(ELISA法)新鮮標本組織液氮碾磨成粉末，稱重，勻漿，離心并分裝凍存于-80 ℃冰箱，按照ELISA試劑盒操作程序依次稀釋標準品、加樣、溫浴、洗滌、加酶(空白孔除外)、溫浴、洗滌、顯色、終止顯色、測定計算終濃度。

1.4結果判定用IHS法

由兩名病理科醫生評分，在400倍顯微鏡下隨機計數5個視野取平均值，根據陽性百分比分：0%～10%，計1分；11%～50%，計2分；51%～80%，計3分；81%～100%，計4分。根據陽性標記顯色程度分：無染色，計0分；淡黃色，計1分；棕黃色，計2分；棕黑色，計3分。根據所得著色細胞數得分與染色強度得分的乘積作為最后結果(0～12分)：0～1分，為陰性(-)；2～4分，為弱陽性(+)；5～8分，為陽性(++)；9～12分，為強陽性(+++)。

1.5統計學分析

2　結果

免疫組織化學染色結果：(1)EGF的表達情況。正常皮膚中染色集于表皮基底層，位于細胞核及部分皮膚附件，真皮結締組織內細胞染色少；HS內陽性染色主要分布于表皮基底層、棘層、表皮等，陽性染色細胞數目較多，染色強度明顯，內皮血管細胞、真皮結締組織中細胞、皮膚附件部分染色，如圖1。EGF在正常皮膚與成人HS中的表達差異有統計學意義(χ2=9.404,P=0.024)(表2)。(2)TGF-β1的表達情況。正常皮膚中主要位于表皮角質形成細胞胞漿和表皮基底層，真皮層內極少有陽性表達；HS中陽性表達于表皮角質形成細胞、表皮基底層和真皮Fb、血管內皮細胞胞漿及皮膚附屬器等，染色密度及強度較正常皮膚高，如圖2。TGF-β1在正常皮膚與成人HS中的表達差異有統計學意義(χ2=7.942，P=0.047)(表3)，TGF-β1和EGF在HS中表達陽性率的相關性采用Spearman相關分析，結果提示二者在HS中表達具有正相關性(r=0.362,P=0.012)(表4)。(3)ELISA檢測統計結果，EGF在正常皮膚和HS中的平均濃度分別是(196.29±7.29)、(237.57±14.43)pg/mL，差異有統計學意義(t=12.44，P=0.001)；TGF-β1在正常皮膚與HS中的平均濃度分別是(246.92±14.93)ng/L、(446.71±59.24)ng/L，差異有統計學意義(t=31.11，P=0.000)；TGF-β1和EGF在HS中濃度表達相關性采用Pearson相關分析，提示二者在HS中表達水平具有正相關性(r=0.330，P=0.017)。

表2 EGF在正常皮膚和HS中的表達比較

組別EGF表達分級n-++++++陽性率(%)正常皮膚211641023.81HS48191610360.42

表3　TGF-β1在正常皮膚和HS中的表達比較

表4TGF-β1與EGF在HS中免疫組化染色表達陽性率的相關性比較

TGF-β1EGF陽性陰性合計R值P值陽性26026陰性319220.3620.012合計291948

3　討論

3.1TGF-β1與HS

HS是人皮膚遭受創傷(如手術、燒傷等)后以Fb過度增殖、ECM過度沉積為主要病理特征并過度愈合所致，TGF-β1參與創傷愈合中炎癥反應、血管和Fb增生、膠原合成與分解以及新的ECM的重建[4]。皮膚表皮和真皮淺層受創缺失后，其深層真皮Fb增殖率較淺層真皮Fb增值率低，由此推測真皮深層的Fb可能是形成HS的主要細胞來源之一[5]。正常皮膚組織淺層的真皮Fb具有抗纖維化特性，而深層的真皮Fb的遷移率較低，合成蛋白能力強，細胞過度增殖，引起ECM過度沉積形成HS[6-7]。

TGF-β1是已被公認的具有最強促纖維化作用的細胞因子(cytokine,CK)，在創面修復愈合過程中持續高濃度、過度表達可能是瘢痕形成的主要原因之一[8]。當皮膚受創后，炎性因子及組織修復因子經TGF-β1趨化下向創面聚集，促Fb分裂和增殖，TGF-β1誘導金屬蛋白酶組織抑制因子-1(tissue inhibitors of MMP-1，TIMP-1)合成下調MMP-9的表達，TGF-β1還抑制MMP2降解膠原，促進ECM過度沉積形成HS[9]。TGF-β1促進TIMPs合成而抑制MMPs表達，致膠原蛋白代謝失衡而異常增生[10-11]。TGF-β1在HS形成中刺激Fb增殖，并促進間質細胞向Fb轉化[12]。TGF-β1刺激I、III型膠原蛋白、整合素等多種ECM合成、沉積，且刺激產生I型膠原致ECM沉積增加促進瘢痕形成[13]。

本實驗免疫組織化學染色顯示TGF-β1在HS中主要表達于表皮角質形成細胞、表皮基底層和真皮Fb、血管內皮細胞胞漿及皮膚附屬器等，染色密度及強度較正常皮膚高，在正常皮膚和HS中的陽性表達率分別為19.04%和54.17%，差異有統計學意義。經ELISA定量檢測表明HS組織中TGF-β1的濃度較正常皮膚組織中高，在正常皮膚和HS中分別為(246.93±14.93)ng/L和(446.71±59.24)ng/L，差異有統計學意義。與眾多研究相似，表達強度與以往文獻報道有差距，考慮與瘢痕年齡等因素有關。

3.2EGF與HS

EGF主由血小板、巨噬細胞等分泌，它和表皮細胞、Fb等胞膜上的EGFR結合，參與細胞的增殖、分化和遷移功能的調節，與創傷修復過程密切相關[14]，EGF家族中涉及創面修復的主要是EGF、TGFα、HB-EGF。體外試驗中，EGFR活化后促進急性創面中表皮細胞增殖和遷移，表皮再生增強，EGF且能夠以近分泌的方式作用于角質細胞，促角質細胞有絲分裂、增殖，進而促使表皮再生和創面抗拉強度[15]。但缺少TGF-β1時并不妨礙創面的愈合，這可能是EGF家族中的其他生長因子具有一定程度的補償作用[16]。EGF對Fb的生長、增殖活性有明顯的促進作用，抑制Fb的凋亡，且刺激膠原的合成、增殖和沉積，當EGF產生過量時促HS形成[17]。當皮膚受創后，創周ESCs增殖分化加快，同時經自身分泌或者促進周邊細胞分泌多種CK(如EGF、FGF、TGF-β1等)，表皮細胞和Fb的生長、增殖加強以及I、Ⅲ型膠原的分泌增多，創面愈合增強[18-19]。有研究發現，瘢痕增生后期EGF含量稍降低，而Fb生長仍表現優勢，故多數瘢痕不能自行消失[20]。本實驗發現在某些HS標本中EGF表達并不明顯，而HS外觀顯著，推測EGF的產生及生物學效應可能存在時向性、濃度依賴性等影響因素。

本實驗免疫組織化學染色，EGF在HS中陽性染色細胞數目、強度較正常皮膚明顯，在正常皮膚和HS中陽性表達率分別為23.81%和60.42%，差異有統計學意義。ELISA定量檢測，EGF在HS與正常皮膚中的濃度分別為(237.57±14.43)pg/mL和(196.29±7.29)pg/mL，差異有統計學意義。這與系列研究結果相似，表明EGF在促進HS形成過程中起著重要作用。

3.3TGF-β1和EGF在HS中陽性表達的相關性

TGF-α和EGF是EGFR的兩種天然配基，它們與EGFR競爭性結合后調節細胞增殖。通過TGF-β1 mRNA原位雜交和VEGF蛋白免疫組織學化染色觀察，發現瘢痕組織中TGF-β1和EGF均明顯增加促進創面上皮化及瘢痕形成[21]。本實驗中免疫組織化學檢測發現二者在HS中均呈明顯高表達，且與正常皮膚中的表達差異有統計學意義，部分HS中TGF-β1和EGF的表達強度具有一致性。據此推測二者在瘢痕增生過程中可能相互正向調節促進其產生、協同發揮生物學效應促HS形成。TGF-β1作用于角質細胞，反過來角質細胞分泌EGF加強創面愈合，創面上皮化作用更明顯。但缺少TGF-β1并不妨礙創面的愈合，這可能是EGF家族中的其他生長因子有一定程度的補償作用[14]。EGF可促表皮細胞、Fb和其他細胞的增殖，促膠原合成與ECM過度沉積。TGF-β1對Fb生長具有雙向調節性，即高濃度時呈現抑制，低濃度時表現為促進。創傷發生后，EGF和TGF-β1均增多，致創面組織Fb濃度增高，當增加到一定程度時TGF-β1增加速度放緩，但創面修復繼續且過度修復而形成瘢痕，這可能是二者之間存在相關性并協同作用致部分瘢痕持續增生的原因之一。

本研究經免疫組織化學染色和ELISA分析發現，TGF-β1和EGF在成人HS中均呈高表達，且二者表達存正相關，兩種檢測表達的相關程度不完全一致(免疫組化時R=0.362,P=0.012；ELISA時R=0.330,P=0.017)，推測與檢測方式、瘢痕標本個體差異等有關。由此推測EGF和TGF-β1在成人HS的發生、發展進程中存在正相關，二者生物學效應的疊加可能是促進HS形成、發展的機制之一。

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(學術編輯：肖文明)

Expression and significance of TGF-β1 and EGF in adult hypertrophic scar

HUANG Ke-hua1,ZHOU Guo-fu2，CHEN-Lang2

(1.Department of Burns and Plastic Surgery,The People’s Hospital of Chongqing Yubei District，Chongqing 401120;2.Department of Burns and Plastic Surgery,Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College,Nanchong 637000,Sichuan,China)

Adult hypertrophic scar;Epidermal growth factor;Transforming growth factor-β1

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.04.027論著

四川省衛生發展研究中心項目(SJWF1311)

2015-06-19

黃克華(1975-)，男，碩士。E-mail：cq023hkh@163.com

周國富，E-mail：2508122390@qq.com

網絡出版時間：2016-8-217∶48網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160802.1748.054.html

1005-3697(2016)04-0548-05

R619.6

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