不同激光輔助孵化對玻璃化冷凍和慢速程序冷凍卵裂期胚胎移植妊娠率的影響

王琦，陳蔚清，張程

(貴州省人民醫院婦科生殖中心，貴州 貴陽　550002)

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不同激光輔助孵化對玻璃化冷凍和慢速程序冷凍卵裂期胚胎移植妊娠率的影響

王琦，陳蔚清，張程

(貴州省人民醫院婦科生殖中心，貴州 貴陽550002)

目的：研究分析兩種激光輔助孵化方法對玻璃化冷凍和慢速程序冷凍卵裂期胚胎移植妊娠率的影響。方法：對2013年11月到2014年7月期間在我院接受冷凍胚胎移植的160例患者進行臨床研究，隨機分為兩組，對照組為進行激光透明帶打孔輔助孵化，研究組進行激光透明帶薄化輔助孵化，比較組間患者的臨床妊娠結局。結果：胚胎經程序冷凍后,研究組胚胎種植率(19.1%)顯著高于對照組(12.3%),差異有統計學意義(P<0.05),而解凍后卵裂球存活率(82.21% vs.77.43%)與臨床妊娠率(37.5% vs.32.5%)無顯著差異(P>0.05)；胚胎經玻璃化冷凍后，研究組和對照組解凍后卵裂球存活率(87.48% vs.87.41%)、胚胎的臨床妊娠率(37.5% vs.35.0%)、種植率(17.5% vs.15.1%)相比較均無統計學差異(P>0.05)；研究組中來源于兩種冷凍方法的卵裂期胚胎解凍后卵裂球存活率(87.48% vs.82.21%)、臨床妊娠率(37.5% vs.37.5%)和種植率(17.5% vs.19.1%)無統計學差異(P>0.05)。結論：激光透明帶削薄優于激光透明帶打孔用于輔助孵化，不影響患者的妊娠率，可減少對胚胎的損害。

激光輔助孵化；凍胚移植；妊娠率

【Abstract】Objective：To study the influence of two kinds of laser assisted hatching method on frozen thawed embryo transfer pregnancy rate during cleavage stage by vitrification freezing and slow freezing program.Methods：In our hospital a clinical study was performed on 160 patients with frozen embryo used laser zona drilling assisted hatching,while the study group used laser zona pellucida thinning assisted hatching,clinical pregnancy outcome was compared between two groups.Results：Firstly,after cryopreservation,the embryo implantation rate in study group (19.1%)was significantly higher than that of the control group (12.3%),the difference was statistically significant (P<0.05),while the survival rate after thawing cleavage (82.21% vs.77.43%)and clinical pregnancy rate (37.5% vs.32.5%)had no significant difference (P>0.05);In addition,after vitrification freezing,the thawing cleavage survival rate (87.48% vs.87.41%),the clinical pregnancy rate of embryo (37.5% vs.35%)and implantation rate(17.5% vs.15.1%)had no statistically significant difference (P>0.05);What is more,the thawing cleavage survival rate (87.48% vs.82.21%),the clinical pregnancy rate of embryo (37.5% vs.37.5%)and the implantation rate (17.5% vs.19.1%)in the study group from two freezing methods,had no significant difference (P>0.05).Conclusion：The laser zona pellucida thinning assisted hatching is superior to laser zona drilling assisted hatching,it doesn't affect the patient’s pregnancy rate and can reduce the damage for the embryo.

【Key words】Laser assisted hatching;Frozen embryo transfer;Pregnancy rate

輔助孵化被用于輔助生殖相關技術已具有較長的時間，近幾年隨著顯微激光相關醫學的快速發展，激光系統由于具有快速、安全、準確等優點而被引入到輔助孵化，且已獲得較好的臨床效果[1-2]。本文關于兩種激光輔助孵化方法對人類早期胚胎解凍后移植妊娠率的影響進行研究分析，所研究的結果報道如下。

1　資料和方法

1.1一般資料

將2013年11月到2014年7月期間在我院接受凍融胚胎移植的160例患者作為臨床研究對象，按照隨機的原則分為兩組，每組80例，對照組中患者的年齡為27～40歲，平均年齡為(35.6±1.2)歲，該組患者子宮膜厚度平均值為(10.6±1.2)mm；研究組中患者的年齡為26～39歲，平均年齡為(35.3±1.0)歲，該組患者子宮膜厚度平均值為(10.7±1.6)mm。兩組排除了宮腔因素引起的不孕患者，且年齡、子宮內膜厚度相似，差異無統計學意義(P>0.05)，可以進行對比分析。

1.2方法

1.2.1D3胚胎評級參照胚胎分級[3]1級：胚胎卵裂球大小均勻，形態規則，透明帶完整；胞質均勻清晰，沒有顆粒現象，碎片0%～5%；2級：胚胎卵裂球大小略不均勻，形態略不規則，胞質可有顆?，F象，碎片10%～20%之間；3級：胚胎卵裂球明顯大小不均，可有明顯的形狀不規則，胞質可有顆粒現象，胞質碎片21%～50%；4級：胚胎卵裂球大小嚴重不均，胞質可有嚴重顆?，F象，胞質碎片>50%。

1.2.2冷凍胚胎選擇(1)正常受精；(2)D1、D2、D3連續發育；(3)D2 在2細胞以上，D3卵裂球數≥6個；(4)胚胎評級2級以上；解凍后胚胎移植的標準：胚胎解凍后有超過50%的卵裂球存活的胚胎認為胚胎解凍后復蘇，并用于移植。

1.2.3胚胎慢速程序冷凍及解凍法(1)胚胎冷凍：冷凍試劑盒Quinn’s胚胎冷凍配套培養基。操作步驟：胚胎于37℃移入Fl(冷凍稀釋培養基(含10%SPS的HEPES液))中，將胚胎在培養皿的不同區域反復沖洗，放置10 min；移入F2(1.5 M PPD溶液)中，于室溫平衡10 min；移入F3(1.5 M PPD+0.1 M蔗糖溶液)中，裝入冷凍麥管并封好管口。將冷凍管置入已在起始溫度的程序冷凍儀(英國Planer公司)中，開始冷凍從室溫(25℃)開始，以2 ℃/min的速度從室溫降至-8 ℃，當溫度穩定在-8 ℃時，進行植冰，并停留10 min，之后以-0.3 ℃/min的速度從-8 ℃降至-30 ℃，再以10 ℃/min的速度從-30 ℃降至-150 ℃，投入液氮，并轉移至保存罐中。(2)胚胎解凍：解凍試劑盒Quinn’s胚胎解凍配套培養基。從液氮罐中取出麥管。在空氣中保持30～40 s。投入37 ℃水浴，30 s，直到冰完全融化，然后將胚胎移入0.5 M蔗糖解凍液中10 min，再移至0.2 M蔗糖解凍液中5 min之后移入HEPES培養基(含10%SPS)中洗7次，最后移至預平衡的卵裂培養基中待行輔助孵化。

1.2.4玻璃化冷凍和解凍法試劑為瑞典Vitrolife卵裂期胚胎玻璃化冷凍/解凍配套培養基。按照試劑盒說明進行冷凍及復蘇。(1)胚胎冷凍：所有的操作均在37 ℃熱臺上進行，把胚胎放入基礎液(不含冷凍保護劑)里平衡5～10 min，然后將胚胎移入以乙二醇作為冷凍保護劑的培養基中2 min，最后在含有丙二醇、聚蔗糖和蔗糖為冷凍保護劑的冷凍液中平衡，30 s內將胚胎移入低溫冷凍載體(瑞典Vitrolife封閉式載體)上并轉移入液氮中保存。(2)胚胎解凍：把冷凍載體從液氮中取出，然后迅速放入Warm1里10～30 s后移入Warm2中1 min后，再移入Warm3中平衡2 min，最后將胚胎置入基礎液中平衡5 min，后移入預先平衡的卵裂培養基中等待行輔助孵化。

1.2.5輔助孵化顯微激光操作系統(美國ZILOS-tK系統)。對照組進行激光透明帶打孔輔助孵化，選取胚胎卵周隙的最大位置持續的以2～3 ms的激光能量進行激光打孔將部分胚胎透明帶切除掉，需保證中心部分完全的穿透透明帶，盡量避免傷害到胚胎細胞，并將胚胎移到培養液滴中置于培養箱保存以等待進行移植；研究組進行激光透明帶削薄輔助孵化，選取胚胎卵周隙的最大位置以4～6 ms的激光能量將削薄1/4左右的胚胎透明帶，削掉約50%～80%的透明帶厚度，并防止穿透透明帶，將胚胎移到培養液滴中置于培養箱保存以等待進行移植。對對照組80例進行激光透明帶打孔輔助孵化，對研究組80例進行激光透明帶削薄輔助孵化，并且每組均有40例為程序冷凍、40例為玻璃化冷凍。將經激光輔助孵化后的卵裂期胚胎在腹部B超的指導下移植到患者的宮腔，并于移植后對患者使用黃體酮或者HCG進行黃體支持。

1.3統計學分析

2　結果

胚胎經程序冷凍后,研究組(激光透明帶削薄)胚胎種植率(19.1%)高于對照組(激光透明帶打孔)(12.3%),差異有統計學意義(P<0.05),而解凍后卵裂存活率(82.21% vs.77.43%)與臨床妊娠率(37.5% vs.32.5%)差異無統計學意義(P>0.05)；胚胎經玻璃化冷凍后，研究組和對照組解凍后卵裂存活率(87.48% vs.87.41%)、胚胎的臨床妊娠率(37.5% vs.35.0%)、種植率(17.5% vs.15.1%)相比較均無統計學差異(P>0.05)；研究組中來源于2種冷凍方法的卵裂期胚胎解凍后卵裂存活率(87.48% vs.82.21%)、臨床妊娠率(37.5% vs.37.5%)和種植率(17.5% vs.19.1%)無統計學差異(P>0.05)。詳細情況如表1、表2所示。

表1　兩組患者的解凍后卵裂球存活率(%)

表2　兩組患者妊娠率與種植率對比(%)

3　討論

由于透明帶能進行局部的裂解是囊胚可以正常的孵出和種植的關鍵因素，而囊胚在體內的動力學相關變化和小分子物質的相互作用可引起透明帶逐漸的擴張及變薄，并于局部出現溶解、斷裂，進而使囊胚的正常孵出及成功種植得到保證[4-5]。但由于所凍融的胚胎透明帶會受到相關理化因素的影響，使糖蛋白的基質出現改變致使透明帶變硬而對囊胚的孵出情況造成一定的影響，所以在對凍融胚胎進行移植之前進行一定的輔助孵化已被逐漸推廣，然而進行輔助孵化是否可以使所凍融胚胎的妊娠率及種植率得到提高尚具有一定的爭議，可能是與所選取的研究對象(如卵裂期胚胎、囊胚)、冷凍的方法(進行程序冷凍、玻璃化冷凍)、輔助孵化的方法(進行化學噴酸輔助孵化、激光輔助孵化)、透明帶的處理程度(進行透明帶的打孔、薄化、切除)等存在不同具有一定關系[6-7]。一般情況下，凍融囊胚的孵出多選擇切除透明帶法，激光薄化法和激光打孔法則常被用于卵裂期胚胎，并且，對透明帶進行激光薄化法比激光打孔法出現孵化嵌頓的情況較少，對于胚胎的安全性更高，臨床使用更加廣泛[8]。

本研究顯示，程序冷凍及玻璃化冷凍下的胚胎復蘇情況之間的差異不明顯(P>0.05)，但研究組與對照組中玻璃化冷凍的解凍后卵裂球存活率明顯高于程序冷凍(P<0.05)，在程序冷凍及玻璃化冷凍情況下研究組的妊娠率高于對照組，但組間差異不明顯(P>0.05)，提示玻璃化冷凍雖然與程序冷凍的臨床結局無差異，但玻璃化冷凍后解凍卵裂球的完整率高，且玻璃化冷凍耗時較短；另外，在程序冷凍解凍之后研究組的種植率明顯高于對照組，(P<0.05)，而玻璃化冷凍之后研究組的種植率差異不明顯(P>0.05)，說明與激光透明帶打孔輔助孵化相比，激光透明帶削薄輔助孵化可使程序冷凍的胚胎的種植率得到明顯提高，而對玻璃化冷凍下種植率無明顯影響?？傊?，進行玻璃化冷凍解凍后胚胎的質量要明顯的優于進行程序冷凍的結果，但在玻璃化冷凍情況下進行激光透明帶打孔與激光透明帶削薄輔助孵化后的妊娠率和種植率與在程序冷凍下相比差異不明顯。目前對于輔助孵化是否改善了IVF的臨床結局尚存在爭議，但我們的觀點認為它是有用的，也許它有助于克服孵化前的機構性阻力，減少了胚胎完成孵化過程所需要的能量從而更利于胚胎的種植。從本研究的結果來看進行激光透明帶削薄比激光透明帶打孔輔助孵化的胚胎種植率更好，也許它更類似于胚胎在自然孵化過程中透明帶自然減薄的過程，并且可能避免對胚胎產生的某些損傷，對胚胎的安全性較好，并且臨床的妊娠率較好，具有一定的臨床意義。

[1]王利紅,鐘景琦,石磊，等.凍融胚胎移植卵裂球數目及胚胎存活狀態與臨床妊娠的關系[J].山東醫藥,2011,51(38):72-73.

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[3]鄧曉惠．生殖醫學技術及其彩色圖譜[M]．濟南:山東科學技術出版社，2004:20-22.

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[5]李脈,周黎明,孫亦婷,等.激光透明帶削薄技術對凍融胚胎移植臨床結局的影響[J].生殖醫學雜志,2013,22(9):658-662.

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(學術編輯：李佳平)

Effects of two kinds of laser assisted hatching method on frozen thawed embryo transfer pregnancy rate during cleavage stage

WANG Qi，CHEN Wei-qing,ZHANG Cheng

(Gynecological Reproductive Center,Guizhou Provincial People’s Hospital,Guiyang 550002,Guizhou,China)

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.04.023論著

貴陽市科技計劃項目(20151001)

2015-12-23

王琦(1979-)，女 ，碩士，主治醫師。E-mail：qixian66888@126.com

網絡出版時間：2016-8-217∶48網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160802.1748.046.html

1005-3697(2016)04-0535-03

R321

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