測定微藻油脂方法的比較研究

張連水　張慧霞　齊樹亭　張君　王海風　張洪志

摘要：以鹽藻為材料，通過便捷性和準確性的比較對酸水解重量法、蘇丹黑B染色法、尼羅紅染色法進行系統研究。為結合酸水解重量法和尼羅紅染色法作出染色藻種油脂含量的標準曲線，實現尼羅紅染色法定量檢測，同時對尼羅紅染色法進行優化改進。

關鍵詞：酸水解重量法；蘇丹黑B染色法；尼羅紅染色法；微藻油脂

不同種類微藻的油脂含量差別很大，油脂含量從1%到70%不等，甚至同一種類的不同品系之間也存在很大的差別。現在已知微藻有10 000余種，從中篩選出油脂含量高的微藻是一項繁重的工作，采用一種簡便、快速、有效的微藻油脂提取方法無疑會事半功倍。目前，研究者常采用油脂提取方法有：酸熱法、索氏提取法、超臨界CO₂萃取法（SCF.CO₂法）和有機溶劑法，有報道利用這四種方法對真菌油脂進行提取，并對提取結果進行了比較，并得出對于微藻而言，尼羅紅是最為簡單、快捷測定油脂的方法。

本實驗通過便捷性和準確性的比較，對酸水解重量法、蘇丹黑B染色法、尼羅紅染色法進行系統研究。為結合酸水解重量法和尼羅紅染色法作出染色藻種油脂含量的標準曲線，實現尼羅紅染色法定量檢測，同時對尼羅紅染色法進行優化改進。

1實驗材料和方法

1.1實驗材料

用于本實驗的鹽藻由海洋中心藻種實驗室提供。藻種使用前進行超聲波破壁處理。由于在之后蘇丹黑B測定油脂含量、尼羅紅測定油脂含量中均需要繪制油脂含量的標準曲線，所以此處藻種均進行冷凍處理，使其生長狀態及油脂含量基本保持在恒定狀態。

1.2實驗方法

將實驗用藻進行擴大培養，每天測定藻樣620 nm處的吸光度，并且進行血球計數板法平行計數，繪制藻樣吸光度值與細胞密度的關系圖。分別用酸水解重量法、蘇丹黑B染色法、尼羅紅染色法對藻類進行油脂含量測定。

探究染色時間對染色后藻液細胞發射光譜的影響。取1.0 mg/mL的鹽藻藻液（之前經過超聲波破壁處理），加人尼羅紅，使其最終質量濃度為1μg/mL，37℃水浴避光染色一段時間（1、3、6、9、12、15、18、20 min），480 nm激發光下，測量580nm處熒光強度。同時探究尼羅紅質量濃度對藻液細胞發射光譜的影響，取8份1.0 mg/mL的鹽藻藻液（之前經過超聲波破壁處理），加入尼羅紅，使其最終質量濃度為分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4μg/mL，37℃水浴避光染色9min，480 nm激發光下，測量580 nm處熒光強度。

2實驗結果與分析

2.1藻體吸光度值與細胞密度的關系

由圖1標準曲線可以看出：鹽藻的個體數與吸光度值基本呈正比，不同濃度的鹽藻液與細胞密度之間的關系系數均較好。經回歸分析，鹽藻的細胞密度與光密度之間成直線關系，由于鹽藻形狀規則，光密度與細胞密度之間的相關性很好。將鹽藻密度與吸光度值進行回歸，回歸方程為：y=0.013 9x-0.0055，R²=0.9792。

2.2酸水解法

對鹽藻進行酸水解法提取油脂測得不同梯度油脂含量，由此數據生成標準曲線、回歸方程和判別系數如圖2。分析得到的判別系數：

R²=0.998 4，表明由兩變量相關性得到的回歸方程適配數據，具有高度的擬合優度。且ml=0.304，m2=0.301 5，相對誤差為0.82%。

2.3藻體濃度與蘇丹黑B染色后A645的標準曲線

由圖3分析得到的判別系數R²=0.9925，表明由兩變量相關性得到的回歸方程適配數據，具有高度的擬合優度。

2.4蘇丹黑B染色后A645與油脂含量的標準曲線

由圖4可分析得到判別系數R³=0.949 4，表明由兩變量相關性得到的回歸方程適配數據，擬合優度一般。且由可行性驗證可知ml=3.097、m2=3.015。相對誤差為2.65%。

由此可以判定經蘇丹黑B染色處理的微藻細胞對645 nm波長光具有最大吸收峰值。微藻油脂含量與經蘇丹黑B染色處理后微藻細胞的吸光值A645呈一定程度的線性相關性，但存在一定誤差。

2.5染色時間對藻液細胞發射光譜的影響曲線

由圖5可知染色時間在8 min之前隨著時間的延長相對熒光強度不斷增大，之后在8～15min之內相對熒光強度基本無明顯變化，15 min之后相對熒光強度明顯下降且下降幅度較大。由此可知最佳染色時間在8～9 min。

2.6尼羅紅質量濃度對藻液細胞發射光譜的影響曲線

由圖6可知尼羅紅終濃度在0.7μg/mL之前隨著濃度的增加相對熒光強度不斷增大，之后尼羅紅濃度在O.7～1.2μg/mL之間相對熒光強度無明顯變化。尼羅紅濃度在1.2μg/mL之上時相對熒光強度緩慢下降，由此可知尼羅紅的最佳終濃度為0.7～1.0μg/mL。

2.7三種方法的對比分析

綜合實驗方法和結論對比分析三種方法的優點和缺點，如表1。

3實驗結論

酸水解稱重法實驗過程耗時較長，且需用到多種有機試劑具有毒性。但實驗結果最為準確，且無論使用任何方法如需定量測定微藻內油脂含量的大小，在繪制標準曲線時均要用到此方法進行協助。蘇丹黑B染色法較為簡便，對實驗藥品實驗器材要求較低，但測量結果并不十分準確，可以作為定性判斷微藻油脂含量的方法。尼羅紅染色法對藥品儀器要求較高，但實驗過程簡便，且實驗精度高。可以作為快速定性判斷微藻油脂含量的方法，也可結合稱重法作為同種藻種快速定量判斷的方法。染色時間對相對熒光強度的影響：尼羅紅染色法的最佳染色時間在8～9 min。尼羅紅終濃度對相對熒光強度的影響：尼羅紅染色法的尼羅紅的最佳終濃度為0.7～1.0μg/mL。