丙泊酚對原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元BDNF和p75NTR水平的影響

李建立，崔紅賞，王　蓓，吳紅海，侯艷寧

丙泊酚對原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元BDNF和p75NTR水平的影響

李建立1，崔紅賞2，王蓓3，吳紅海4，侯艷寧4

目的 探討丙泊酚對原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元凋亡的影響及可能機制。方法 原代培養(yǎng)7 d的大鼠皮層神經(jīng)元，隨機分為兩組：溶劑對照組（給予相同容積的20%脂肪乳劑），丙泊酚組（丙泊酚終濃度為500 μmol/L），上述藥物處理皮層神經(jīng)元12 h后，用光學(xué)顯微鏡觀察兩組皮層神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)變化，MTT法檢測神經(jīng)元存活率的變化，Western blot法檢測神經(jīng)元腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、p75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體（p75NTR）以及B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（Bcl-2）蛋白水平的變化。結(jié)果 與溶劑對照組比較，丙泊酚組光鏡下觀察顯示皮層神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，胞體立體感消失，細(xì)胞輪廓不清，神經(jīng)元軸突斷裂。神經(jīng)元存活率顯著性下降（P＜0.01），BDNF和Bcl-2蛋白水平顯著性下降（P＜0.01），p75NTR蛋白水平顯著性增加（P＜0.01）。結(jié)論 丙泊酚可引起發(fā)育期原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元損傷，其機制可能與下調(diào)BDNF、Bcl-2和上調(diào)p75NTR蛋白水平有關(guān)。

原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元；丙泊酚；神經(jīng)凋亡；BDNF；p75NTR；Bcl-2

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-5-9 15：43：10 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160509.1543.026.html

全世界每年有眾多患兒由于各種原因需要接受全身麻醉。丙泊酚通過激動γ氨基丁酸A型受體和抑制N-甲基-D-天冬氨酸受體發(fā)揮麻醉作用。丙泊酚因具有起效快、消除快、不良反應(yīng)少等優(yōu)點，被廣泛用于麻醉誘導(dǎo)和維持。雖然藥典顯示丙泊酚慎用于3歲以下患兒，但在實際臨床工作中，丙泊酚被廣泛應(yīng)用于嬰幼兒麻醉。目前有關(guān)丙泊酚是否具有發(fā)育期神經(jīng)毒性、對發(fā)育期大腦產(chǎn)生神經(jīng)損傷觀點不一。最近體外細(xì)胞研究［1-3］表明丙泊酚可誘導(dǎo)原代培養(yǎng)神經(jīng)元產(chǎn)生凋亡樣損傷，但其機制尚未完全明確。作為神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的一員，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的含量最為豐富，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，BDNF對神經(jīng)元的發(fā)育、存活、分化等發(fā)揮著重要的作用，具有保護神經(jīng)元免受外界環(huán)境刺激的損傷以及促進受損神經(jīng)元再生的功能［4］。該研究擬通過觀察丙泊酚對發(fā)育期原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元以及對BDNF、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）和p75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體（p75 neurotrophic receptor，p75NTR）蛋白水平的影響，探討丙泊酚發(fā)育期神經(jīng)毒性的發(fā)生機制。

1　材料與方法

1.1藥物與試劑 丙泊酚（diprivan，批號：KW814）購自意大利AstraZeneca公司；20%脂肪乳購自廣州百特公司；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、Neurobasal培養(yǎng)液、B27促生長劑購自美國Gibco公司；DMSO、MTT購自美國Sigma公司；胰蛋白酶購自北京索來寶公司；微管相關(guān)蛋白2（microtubule-associated protein 2，MAP-2）、BDNF、Bcl-2和p75NTR購自美國Santa Cruz公司。

1.2皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng) 取新生的SD幼鼠（24 h內(nèi)）大腦雙側(cè)額葉皮質(zhì)，在冷PBS液中洗劑，剪碎，置入0.125%胰蛋白酶中，放入37℃水浴鍋內(nèi)充分消化15 min，然后用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，吸棄上清液，然后把細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，用巴氏滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。然后經(jīng)100目鋼絲篩過濾，計數(shù)后按1×109/L的密度接種于經(jīng)多聚賴氨酸處理的培養(yǎng)板中，置于5%CO2培養(yǎng)箱37℃恒溫培養(yǎng)24 h后，全量換Neurobasal+B27培養(yǎng)基培養(yǎng)，以后每隔2 d半量換液1次。體外培養(yǎng)7 d的神經(jīng)元用于實驗。

1.3實驗分組 隨機分為溶劑對照組（給予相同容積的20%脂肪乳劑），丙泊酚組（丙泊酚終濃度為500 μmol/L）。

1.4免疫組化鑒定皮層神經(jīng)元 體外培養(yǎng)7 d的皮層神經(jīng)元用多聚甲醛固定30 min，PBS洗3遍，每次5 min，然后用10%山羊血清封閉30 min，PBS洗3遍，每次5 min，加入鼠抗MAP-2（1∶200），4℃過夜。PBS洗3遍，每次5 min，然后加入熒光二抗（1∶100），37℃孵育1 h，PBS洗3遍，每次5 min，熒光顯微鏡下觀察，計數(shù)。

1.5光鏡顯微鏡下觀察不同藥物處理后皮層神經(jīng)元的形態(tài)變化 將細(xì)胞接種于6孔板，體外培養(yǎng)至7 d，按上述分組方法分別加入不同的藥物處理12 h，在光鏡顯微鏡下觀察不同藥物處理后皮層神經(jīng)元的形態(tài)變化。

1.6MTT法檢測神經(jīng)元存活率 將細(xì)胞接種于96孔板，體外培養(yǎng)至7 d，按上述分組方法分別加入不同的藥物處理12 h，移去培養(yǎng)液，每孔加入10 μl MTT液，37℃孵育4 h，加入200 μl DMSO輕輕振蕩溶解甲臜結(jié)晶，在多功能酶標(biāo)儀上測定570 nm的吸光度（optical density，OD）值。以對照組平均OD值為100%，細(xì)胞存活率（%）=處理組OD值/對照組OD值×100%。

1.7Western blot法測定BDNF、Bcl-2和p75NTR蛋白含量 神經(jīng)元經(jīng)各種處理后，收集神經(jīng)元，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，用BCA法檢測蛋白含量。取待測蛋白質(zhì)50 μg加上樣緩沖液煮沸變性，于10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中100 V電泳1.5 h，轉(zhuǎn)膜2 h，加入BDNF、Bcl-2和p75NTR抗體（1∶1 000），4℃過夜，常規(guī)洗滌，加羊抗鼠二抗（1∶5 000），37℃孵育60 min，洗滌，電化學(xué)法發(fā)光，顯影，掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶與內(nèi)參照條帶OD比值。實驗重復(fù)3次，設(shè)β-actin蛋白為內(nèi)參。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進行分析。計量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗。

2　結(jié)果

2.1原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元鑒定 MAP-2行原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元鑒定，神經(jīng)元純度＞90%。

2.2丙泊酚對原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元形態(tài)的影響原代培養(yǎng)7 d的大鼠皮層神經(jīng)元經(jīng)丙泊酚處理12 h后在光學(xué)顯微鏡下觀察，顯示溶劑對照組神經(jīng)元生長良好，神經(jīng)元胞體豐滿，突起較長，相互之間形成復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。丙泊酚組神經(jīng)元生長狀態(tài)差，神經(jīng)元胞體立體感消失，顏色變暗，細(xì)胞輪廓不清，神經(jīng)元軸突斷裂，部分神經(jīng)元出現(xiàn)死亡。見圖1。

2.3丙泊酚對皮層神經(jīng)元存活率的影響 與對照組（99.8±4.1）%比較，丙泊酚組神經(jīng)元存活率（54.4±6.4）%顯著性下降（t=8.457，P＜0.01）。見圖2。

圖1　不同處理對皮層神經(jīng)元形態(tài)的影響 ×200A：溶劑對照組；B：丙泊酚組

圖2　丙泊酚對神經(jīng)元存活率的影響（n=6，±s）與對照組比較：**P＜0.01

2.4丙泊酚對皮層神經(jīng)元BDNF蛋白水平的影響與對照組比較，丙泊酚組皮層神經(jīng)元BDNF蛋白水平顯著性下降（t=7.892，P＜0.01）。見圖3。

圖3　丙泊酚對神經(jīng)元BDNF表達的影響（n=3，±s）與對照組比較：**P＜0.01

2.5 丙泊酚對皮層神經(jīng)元Bcl-2蛋白水平的影響與對照組比較，丙泊酚組皮層神經(jīng)元Bcl-2蛋白水平顯著性下降（t=4.215，P＜0.01）。見圖4。

圖4　丙泊酚對神經(jīng)元Bcl-2表達的影響（n=3，±s）與對照組比較：**P＜0.01

2.6丙泊酚對皮層神經(jīng)元p75NTR蛋白水平的影響 與對照組比較，丙泊酚組皮層神經(jīng)元p75NTR蛋白水平顯著性增加（t=8.432，P＜0.01）。見圖5。

圖5　丙泊酚對神經(jīng)元p75NTR表達的影響（n=3，±s）與對照組比較：**P＜0.01

3　討論

麻醉藥是否影響發(fā)育期神經(jīng)元，影響突觸的形成，是目前臨床和基礎(chǔ)研究的一個重要課題。近年來一些研究［5］表明全麻藥具有發(fā)育期神經(jīng)毒性，可誘導(dǎo)發(fā)育期大腦神經(jīng)損傷。丙泊酚作為臨床上常用的一種全身麻醉藥，具有起效快、消除迅速和不良反應(yīng)少的優(yōu)點，成為小兒麻醉時常用的麻醉藥之一。丙泊酚是否適合應(yīng)用于新生兒和嬰幼兒的全身麻醉，目前仍存在爭議。最近動物實驗研究［6-8］表明丙泊酚可對發(fā)育期動物大腦廣泛腦區(qū)產(chǎn)生凋亡樣損傷，并引起動物成年后的學(xué)習(xí)記憶功能障礙。為進一步了解丙泊酚是否可對發(fā)育期大腦產(chǎn)生神經(jīng)損傷，該研究擬觀察丙泊酚對原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元的損傷作用以及與BDNF、Bcl-2和p75NTR蛋白變化的關(guān)系，結(jié)果顯示丙泊酚通過降低BDNF、Bcl-2和增加p75NTR蛋白水平引起神經(jīng)元形態(tài)學(xué)損傷，同時引起神經(jīng)元存活率接近50%的下降。

關(guān)于丙泊酚引起發(fā)育期神經(jīng)元損傷的機制目前仍不清楚。神經(jīng)營養(yǎng)因子包括神經(jīng)生長因子、BDNF、神經(jīng)生長因子-3和堿性成纖維細(xì)胞生長因子等。BDNF作為在神經(jīng)系統(tǒng)主要表達的神經(jīng)營養(yǎng)因子，廣泛存在于大腦皮層和海馬組織，對神經(jīng)元的增殖和存活發(fā)揮著重要的作用［9］。BDNF與TrkB結(jié)合后啟動細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑包括激活轉(zhuǎn)錄因子CREB，上調(diào)Bcl-2的表達，保護神經(jīng)元免受外界刺激的損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護作用［10］。Bcl-2作為一種抗凋亡蛋白，存在于線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等結(jié)構(gòu)，促進細(xì)胞存活、抑制細(xì)胞凋亡，其水平降低可能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［11］。以往研究［1，12］表明丙泊酚引起發(fā)育期大鼠大腦神經(jīng)損傷與BDNF和Bcl-2蛋白水平的下降有關(guān)。本實驗結(jié)果顯示與溶劑對照組比較，500 μmol/ L丙泊酚作用神經(jīng)元12 h引起神經(jīng)元BDNF和Bcl-2蛋白水平的顯著性下降，說明丙泊酚誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元損傷可能與神經(jīng)元BDNF和Bcl-2蛋白水平的下降有關(guān)。神經(jīng)營養(yǎng)因子低親和力受體p75NTR屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員，是已知最早分離出來的神經(jīng)營養(yǎng)因子受體，在發(fā)育過程中呈高表達，隨著發(fā)育過程的結(jié)束其表達量逐漸降低。p75NTR在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布，以往認(rèn)為p75NTR與神經(jīng)營養(yǎng)因子作用一致，二者結(jié)合后會促進神經(jīng)元的存活與分化。然而近年來顯示在一些中樞神經(jīng)疾病的發(fā)病過程中p75NTR的表達增加，敲除或阻斷p75NTR信號可促進神經(jīng)元存活，延緩疾病的發(fā)生［13］，p75NTR表達增加可促進神經(jīng)元凋亡。研究［14-15］表明全身麻醉藥異氟醚以及咪達唑侖，異氟醚和笑氣聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)的發(fā)育期大鼠大腦廣泛腦區(qū)凋亡樣損傷可能與p75NTR蛋白水平的增加有關(guān)。本實驗結(jié)果顯示與溶劑對照組比較，500 μmol/L丙泊酚作用神經(jīng)元12 h引起神經(jīng)元p75NTR蛋白水平的明顯增加，說明丙泊酚誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元損傷也可能與神經(jīng)元p75NTR蛋白水平增加有關(guān)。

綜上所述，丙泊酚可誘導(dǎo)原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元損傷，其機制可能與BDNF和Bcl-2蛋白水平的下降和p75NTR蛋白水平增加有關(guān)。

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Effects of propofol treatment on BDNF and
p75NTR expression in primary cultured cortical neurons

Li Jianli1，Cui Hongshang2，Wang bei3，et al
（1Dept of Anesthesiology，2Dept of Thoracic Surgery，3Dept of Gynecology，Hebei General Hospital，Shi Jiazhuang 050051）

Objective To investigate the effect of propofol exposure on neuroapoptosis in primary cultured cortical neurons and the mechanisms.Methods Cortical neurons were primarily cultured for seven days，then divided into two groups：vehicle-control group（treated with equal valume of 20%intralipid），propofol-treated group（treated with 500 μmol/L propofol）.The neurons were treated for 12 h.The structure of neurons was analyzed using microscope，the neuron viability was determined by MTT，and Western blot was performed to detect the levels of BDNF，p75NTR and Bcl-2.Results Lack of three-dimensional sense，faded color，unclear outline were observed，and fractured neuron axons or neurons death were observed in neurons treated by 500 μmol/L propofol.Compared with vehicle-control group，the neuron viability decreased greatly（P＜0.01），BDNF and Bcl-2 levels decreased greatly（P＜0.01）and p75NTR level increased greatly in propofol treatment group（P＜0.01）.Conclusion Propofol induces neuroapotosis in primary cultured cortical neurons，which is associated with the decreased levels of BDNF and Bcl-2 and the increased level of p75NTR.

primary cultured cortical neurons；propofol；neuroapoptosis；BDNF；p75NTR；Bcl-2

R 971.2；R 965

A

1000-1492（2016）06-0818-04

2016-01-18接收

河北省衛(wèi)生廳指令課題（編號：ZL20140095）

河北省人民醫(yī)院1麻醉科、2胸外科、3婦產(chǎn)科，石家莊0500514白求恩國際和平醫(yī)院藥劑科，石家莊 050082

李建立，男，副教授，醫(yī)學(xué)博士；侯艷寧，女，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：biph2011 @163.com