改進的流式細胞積分對骨髓增生異常綜合征診斷價值的研究

郭進京，王會平，熊術道，孫　磊，翟志敏

改進的流式細胞積分對骨髓增生異常綜合征診斷價值的研究

郭進京1，2，3，王會平1，2，熊術道1，2，孫磊1，2，翟志敏1，2

篩選94例患者評價改進的流式細胞術（FCM）積分在骨髓增生異常綜合征（MDS）中的診斷效能。用抗體組合CD34/CD19/CD33/CD45分析四參數流式積分，通過CD19和CD33將B系和髓系前體細胞分離。對疑為MDS的患者行流式積分，評價兩種方法的診斷參數。改進的積分有更高的診斷參數。11例通過改進的方案改變積分，其中5例因積分改變獲得正確診斷。改進積分實用方便，更好地分離B系和髓系前體細胞。

骨髓增生異常綜合征；流式細胞術；免疫表型

網絡出版時間：2016-5-9 15：43：11 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160509.1543.066.html

骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes，MDS）是一組克隆性源于造血干細胞的髓樣腫瘤［1］。有較高的風險演變為急性髓系白血病［2］。其年發病率每10萬人口約為5例，60歲后年發病率增至每10萬人口約20～50例［3］。MDS診斷主要依靠骨髓形態學檢測病態造血和細胞遺傳學克隆性改變及其他的異常，如骨髓鐵染色環形鐵粒幼細胞≥15%［4］，但低危MDS患者半數初診時無上述異常。流式細胞術（flow cytometry，FCM）分析細胞免疫表型的異常可彌補形態學和遺傳學的不足，多個研究［5］組織標準化操作流程用FCM對MDS進行診斷，表明FCM檢測細胞發育不良比形態學更敏感。Della Porta et al［6］整合多中心實驗室數據制定了FCM積分四參數評分MDS，具有很高的診斷效能。該研究通過一組抗體組合，改進設門方案來評估FCM積分四參數，并評估改進方案的臨床診斷效能。

1　材料與方法

1.1病例資料 收集安徽醫科大學第二附屬醫院血液科因外周血一系或多系減少而就診的患者108例，行細胞形態學、染色體以及鐵染色等檢查，同時行FCM積分方案分析。參照維也納最低診斷標準和2008年WHO分型［4，7］對疑為MDS的患者進行診斷和分類。首次檢測47例符合MDS確定標準，30例為非克隆性血細胞減少，31例為意義未明的特發性血細胞減少癥（idiopathic cytopenia of uncertain significance，ICUS）。31例ICUS患者隨訪6個月，其中7例診斷為MDS；10例失訪；11例為非MDS，其中1例因CD34+細胞過少而剔除；3例為慢性單核細胞白血病。最終確診54例MDS患者和40例非MDS患者，并納入研究，其中MDS患者男33例，女21例；年齡20～86歲，中位年齡66歲。非MDS患者男25例，女15例；年齡22～81歲，中位年齡64歲。MDS和非MDS組患者年齡差異無統計學意義（t=1.557，P=0.123）。診斷資料見表1。

1.2FCM積分方案的流式分析

1.2.1樣本制備 抽取新鮮骨髓，肝素抗凝，加入抗體組合，避光孵育，氯化銨溶血，上機測試。所用的抗體組合為CD34-FITC、CD19-PE、CD33-APC、CD45-PC7，所有抗體購自美國Beckman Coulter公司，使用FC500 MPL流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）進行分析，分析軟件為EXPO 32 Multi-Comp software（美國Beckman Coulter公司）。每測試管至少計數105個有核細胞和500個CD34+細胞。

1.2.2設門策略 用上述抗體組合進行分析，設門。如圖1所示：①在FSC和SSC散點圖上，設P1門去除細胞碎片，代表全部有核細胞。在P1門中選擇SSC較小的細胞群設為P2門；②P2門中的細胞表達在CD34和CD45的散點圖上，設置CD34+CD45dim的細胞為P3門，代表原始細胞群；③P3門中的細胞表達在CD19和CD33的散點圖上，CD33+CD34+CD45dim代表髓系前體細胞：D門，CD19+CD34+CD45dim代表B系前體細胞：C門，此為本研究改進的設門方案；④P3門中的細胞表達在CD45和SSC的散點圖上，其中表達更低的SSC和CD45的細胞群為B系前體細胞：P5門，剩余的細胞為P4門為髓系前體細胞，此為參考文獻的方法分離B系和髓系前體細胞；⑤P1門中的全部有核細胞表達在CD45和SSC的散點圖上，P6代表淋巴細胞，P7代表粒細胞；⑥淋巴細胞CD45的平均熒光強度；⑦髓系前體細胞CD45的平均熒光強度；⑧粒細胞SSC的峰值強度；⑨淋巴細胞SSC的峰值強度。

1.3評分標準 根據文獻［6］評分標準如下：髓系前體細胞和有核細胞的比值≥2%（參數1）；B系前體細胞和CD34+細胞的比值≤5%（參數2）；淋巴細胞和髓系前體細胞CD45平均熒光強度的比值≤4或≥7.5（參數3）；粒細胞和淋巴細胞SSC峰值的比值≤6（參數4）。每個參數符合標準計分為1分，不符合為0分，總積分≥2診斷為MDS。

圖1　抗體組合CD34/CD19/CD33/CD45分析FCM積分四參數A：全部有核細胞P1和低SSC表達的P2；B：P2在CD34和CD45中的表達，CD34+CD45dim為P3；C：P3在CD19和CD33中的表達，此為改進方案分離髓系和B系前體細胞；D：P3在CD45和SSC中的表達，此為文獻方案分離髓系和B系前體細胞；E：P1在CD45和SSC中的表達，P6為淋巴細胞，P7為粒細胞；F：淋巴細胞CD45的平均熒光強度；G：髓系前體細胞CD45的平均熒光強度；H：粒細胞SSC的峰值強度；I：淋巴細胞SSC的峰值強度

表1　患者診斷結果（n）

1.4統計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行分析。如參數為正態分布，兩組均數比較用獨立樣本t檢驗，非正態分布的差異比較采用Z檢驗。使用配對四格表Χ2檢驗比較兩種方案診斷94例患者資料的差異。

2　結果

2.1MDS組和非MDS組人口資料和四參數分析

MDS組中位積分和中位參數1明顯高于非MDS組，而中位參數2和中位參數4均明顯低于非MDS組，兩組中位參數3差異無統計學意義，但統計顯示MDS組中位參數3結果不符合高斯分布，正態性檢驗P=0.033，而非MDS組為高斯分布，正態性檢驗P=0.791。見表2。

表2　MDS組和非MDS組患者人口資料和四參數分析

2.2改進的FCM積分和文獻FCM積分診斷效能的比較

2.2.1改進的FCM積分診斷MDS的效能 以≥2分診斷為MDS，54例MDS中有52例診斷正確，敏感性為96.3（49/54），40例非MDS中有5例≥2分，特異性為87.5%（35/40）。診斷符合率為92.6%［（52+35）/（54+40）］。陽性似然比和陰性似然比分別為7.7［敏感性/（1-特異性）］和0.04［（1-敏感性）/特異性］。

2.2.2參考FCM積分診斷MDS的效能 按參考方法進行評分，54例MDS中49例診斷符合，敏感性為90.7%，40例非MDS中7例≥2分，特異性為82.5%，診斷符合率為87.2%，陽性似然比和陰性似然比分別為5.2和0.1。

2.2.3配對四格表比較兩種FCM積分的診斷效能兩種方案分別對94例患者進行評分，以≥2分為界，診斷為MDS，采用配對設計四個表的Χ2檢驗比較兩種積分的診斷效能是否有差異。兩種積分方案診斷MDS差異無統計學意義（Χ2=74.343，P= 1.000），且兩種方案有很強的診斷吻合度（k= 0.889，P=0.000）。見表3。

表3　改進的流式積分和參考流式積分在診斷MDS中的比較（n）

3　討論

因MDS異質性的特點，臨床診斷較為困難。形態學和遺傳學是確診MDS的主要檢查，而形態學的檢測易受骨髓采集、制片水平、染色因素的影響，且異質性使細胞分化成熟障礙，在判斷分化階段上易受操作者主觀判斷［8］，遺傳學有明確的染色體檢出可確診MDS，但近一半的患者無異常染色體核型［9］。FCM檢測骨髓標本質量優劣對免疫表型分析的影響不如對形態學那么明顯［10］，故很多研究機構制訂了診斷MDS的積分系統，但大多需要標記多個抗體組合，分析復雜，不易被臨床醫師解讀，也加重了患者的經濟負擔。Della Porta et al［6］制定的四參數FCM積分有很高的診斷參數，尤其實用于低危MDS患者的診斷。本研究證實了該方法的臨床實用性，同時本研究改進了設門方案，僅需4個抗體，一個組合就能分析該四參數積分，四色的流式分析儀就可以做到，用CD19和CD33在CD34+的細胞群中的表達代替文獻中用SSC和CD45表達的強度把B系前體細胞和髓系前體細胞分離，文獻方案僅憑更弱表達的SSC和CD45分離B系前體細胞，易受操作者主觀判斷，本改進方案杜絕了操作者主觀的因素。在臨床資料研究中，改進的FCM積分似乎有更高的靈敏度和特異性以及診斷符合率，11例因方法學的改變而改變了FCM積分，11例中有5例因積分的改變而得到正確的診斷，其中MDS組有3例用改進的FCM積分糾正了參考方案的診斷，非MDS組有2例糾正了參考方案的診斷。Χ2檢驗比較改進的FCM積分和參考FCM積分診斷MDS無差異性，說明改進的流式方案能勝任文獻中FCM積分的分析。

本改進方案僅代表本院的臨床資料，尚需更多實驗室數據來驗證這種簡潔方便、經濟實用、高診斷參數、易于推廣的篩查MDS的FCM積分方案。

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On the value of improved flow cytometry score in MDS diagnosis

Guo Jinjing1，2，3，Wang Huipin1，2，Xiong Shudao1，2，et al
（1Dept of Hematology，The Second Hospital of Anhui Medical University，2Hematology Research Center，Anhui Medical University，Hefei 230061；3Dept of Laboratory Medicine，Fuyang Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Fuyang People's Hospital，Fuyang 236400）

Screening 94 patients to evaluate the diagnostic effectiveness of an improved FCM-score in MDS.A set of antibody combination：CD34/CD19/CD33/CD45 was used to analyze the four parameters FCM-score，and through CD19 and CD33 to separate progenitor B-cell blasts and myeloblasts.Analysis of the FCM-score in patients with suspected MDS，and the diagnostic parameters of the two methods were evaluated.The improved FCM-score had higher diagnosis parameters.11 patients with improved method changed the integral，5 of 11 cases changed classification and got correct diagnosis.The improved FCM-score is simple and easy，and can better separate of progenitor B-cell blasts and myeloblasts.

myelodysplastic syndromes；flow cytometry；immunophenotype

R 551.3

A

1000-1492（2016）06-0903-04

2016-03-08接收

國家自然科學基金（編號：81141104）；安徽省高校省級自然科學研究項目（編號：KJ2014Z017）

1安徽醫科大學第二附屬醫院血液內科，合肥 2306012安徽醫科大學血液病研究中心，合肥 2300613安徽醫科大學附屬阜陽市人民醫院檢驗科，阜陽230601

郭進京，男，碩士研究生；翟志敏，女，主任醫師，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：zzzm889@163.com