變性高效液相色譜技術(shù)鑒別豬牛源性成分的試驗

楊　娜,王向軍,喬　晴,徐　超

(河南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心,河南鄭州450003)

變性高效液相色譜技術(shù)鑒別豬牛源性成分的試驗

楊娜,王向軍,喬晴,徐超

(河南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心,河南鄭州450003)

建立了檢測動物源性食品中豬、牛成分的PCR結(jié)合變性高效液相色譜技術(shù),為牛、羊成分的鑒別提供一種新的分子診斷技術(shù).以豬、牛的線粒體DNA為靶基因,設(shè)計特異性PCR引物.雙重PCR擴增后,DHPLC分析.經(jīng)優(yōu)化DHPLC最佳條件為:使用PS-DVB&C18 DNASep色譜柱(4.6 mmX50 mm,粒度3 μm),設(shè)定50℃柱溫,起始流動相為: 45%緩沖液A和55%緩沖液B,流速0.9 mL/min;上樣量:PCR產(chǎn)物5 μL.結(jié)果表明:DHPLC法具有良好的特異性,僅能檢出豬、牛源成分,而與羊、雞、鴨源成分無交叉反應(yīng);方法的靈敏度可以達到1 000 copies核酸.

變性高效液相色譜法;豬源性成分;牛源性成分;鑒定

我國已經(jīng)成為世界第一位的動物源性食品生產(chǎn)大國,在豬、牛源性食品生產(chǎn)的總量和增長幅度方面保持著全球第一.但受經(jīng)濟利益驅(qū)動,我國動物源性食品摻假的手段和花樣在不斷地翻新,甚至規(guī)?；庵破窊郊俚默F(xiàn)象也越來越嚴重.因此,基于食品安全、宗教原因和營養(yǎng)成分的考慮,有必要對動物源性成分來源鑒別和追溯研究,開發(fā)一種安全、快速、自動化、高通量的檢測技術(shù)確有必要.

高效變性液相色譜技術(shù)(Denaturing high per?formance liquid chromatograph,DHPLC)是近年來發(fā)現(xiàn)起來的一種快速核酸分析方法[1].通過增加流動相中具有親水性的乙腈濃度,逐漸造成DNA和TEAA的脫離,核酸片段就會按分子量大小洗脫而分離.用DHPLC可以區(qū)分不同長度DNA片段的特點,國內(nèi)外已經(jīng)應(yīng)用DHPLC進行病原的分型鑒別[2],遺傳疾病的突變分析、食品微生物的檢測等.本文采用PCR擴增結(jié)合非變性DHPLC分析模式,研究建立了食品中豬牛源成分的快速、自動化鑒別方法.

1　材料與方法

1.1材料和設(shè)備無污染的豬肉、牛肉、羊肉、鴨肉和雞肉,由河南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心鑒定保存;2XTaq-PCR Master Mix,瓊脂糖,100bp DNA ladder,購自天根生化科技(北京)有限公司;三乙胺乙酰鹽(TEAA),購自美國WAVE公司;DNA Isolation Reagent for Meat and Meat Prod?ucts,購自寶生物工程(大連)有限公司;乙腈HPLC級別.

G:BOX-HREM全自動凝膠成像分析系統(tǒng),購自美國SYNGENE公司;LabCycler Standard Plus梯度PCR儀,購自德國Senso公司;Wave4500變性高效液相色譜儀,購自美國環(huán)球基因公司;BioSpecnano紫外可見分光光度計,購自日本島津公司.

1.2方法

1.2.1引物的設(shè)計和合成在NCBI上查找豬、牛線粒體DNA基因序列,比對分析后設(shè)計引物如下:豬源性成分:上游引物5′-GCCTAAATCTCCCCTCAATGCTA-3′,下游引物5′-ATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG-3′;牛源性成分的引物:上游引物5′-GCCATATACTCTCCTTGGTGACA-3′,下游引物5′-GTAGGCTTGGGAATAGTACGA-3′.引物均由寶生物工程(大連)有限公司合成.

1.2.2動物源成分DNA的提取分別稱取50 mg的豬肉、牛肉、羊肉、鴨肉和雞肉于1.5 mL的離心管中,參照TaKaRa DNA Isolation Reagent for Meat and Meat Products說明書操作,50 μL純水溶解DNA后,-20℃保存?zhèn)溆?

1.2.3PCR反應(yīng)體系和重組質(zhì)粒構(gòu)建以提取的豬肉、牛肉、羊肉、鴨肉和雞肉的DNA為模板,PCR擴增.反應(yīng)體系體積50 μL:2XTaq-PCR Mas?ter Mix 25 μL、引物各1 μL、模版DNA 5 μL、滅菌超純水18 μL.反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min,95℃變性1 min、56℃退火40sec、72℃延伸40sec,共30個循環(huán).將陽性擴增產(chǎn)物送寶生物工程(大連)有限公司克隆測序.

1.2.4DHPLC分析條件使用PS-DVB&C18 DN?ASep色譜柱(4.6 mmX50 mm,粒度3 μm),柱溫為50℃;起始流動相為:45%緩沖液A(0.1 mol/L TEAA pH值7.0),55%緩沖液B(0.1 mol/L TEAA,25%乙腈pH值7.0);終止流動相為:38.8%的緩沖液A,61.2%緩沖液B;流速:0.9 mL/min;上樣量:PCR產(chǎn)物5 μL.

1.2.5DHPLC特異性試驗分別提取豬肉、牛肉、羊肉、鴨肉和雞肉的基因組,進行PCR擴增后,DHPLC儀檢測分析結(jié)果.

1.2.6DHPLC靈敏度試驗分別PCR擴增豬源和牛源成分,克隆構(gòu)建豬源和牛源成分的重組質(zhì)粒.等比例混合陽性重組體后,10倍比稀釋為106,105,104,103,102,10和1個copies核酸.參照1.2.4DHPLC分析條件檢測,研究方法的敏感性.

1.2.7實際樣品檢測對超市和農(nóng)貿(mào)市場購買的27份食品樣品平行進行DHPLC和商品化定量PCR方法檢測.

2　結(jié)果

2.1PCR擴增和克隆結(jié)果以提取的豬肉、牛肉、鴨肉、雞肉和羊肉的DNA為模板,擴增出牛肉和羊肉成的目的片段,而豬肉、鴨肉和雞肉的PCR擴增結(jié)果為陰性(圖1).克隆豬、牛成分的序列在NCBI上的比對結(jié)果表明獲得特定的目的片段.

圖1　動物源性成分的PCR擴增結(jié)果

2.2DHPLC的特異性試驗結(jié)果PCR擴增,DH?PLC分析后發(fā)現(xiàn),5.1 min出現(xiàn)豬源成分,6.4 min出現(xiàn)牛源成分的特征性吸收圖譜.而羊肉、雞肉、鴨肉為陰性結(jié)果.見圖2.

2.3敏感性實驗結(jié)果對稀釋為106,105,104,103,102,10和1 copies的重組質(zhì)粒,進行PCR-DHPLC檢測.1 000個copies的質(zhì)粒可以擴增出陽性結(jié)果,而 100 copies的質(zhì)粒未能擴增出結(jié)果(圖3).

2.4實際樣品檢測結(jié)果對27動物源性食品的檢測結(jié)果表明,DHPLC方法和定量PCR方法的結(jié)果一致,兩者的符合率為100%.

圖2　DHPLC檢測的特異性實驗結(jié)果

3　討論

對動物源性成分檢測技術(shù)通常建立在對樣品的物理形態(tài)特性、抗原抗體反應(yīng)、有鑒別意義的基因組序列、標志性蛋白質(zhì)或多肽的基礎(chǔ)上,涉及的技術(shù)包括:顯微鏡觀察[3]、ELISA方法[4-5]、定量或常規(guī)PCR法[6-9]、雙向電泳[10]、質(zhì)譜技術(shù)[11-13]等.顯微鏡觀察是被歐盟(EU)認可的檢測動物源性成分的官方方法,但需要顯微鏡分析師達到較高的專業(yè)水平,所測結(jié)果與試驗員的經(jīng)驗相關(guān)性很大,具有一定的主觀性.ELISA等免疫學分析方法主要檢查新鮮肉制品,一般不能用于熱加工處理的食品.雙向電泳、質(zhì)譜技術(shù)等方法在實際應(yīng)用中較少,因為無論是二維電泳還是質(zhì)譜等都對儀器、試劑和樣品處理具有較高要求,而且該類方法在分析混合成分時難度較大.基于核酸的分析技術(shù),充分利用DNA分子除了具有種內(nèi)保守性高,種間特異性強的優(yōu)點外還具有較高的熱穩(wěn)定性,而且其核苷酸序列不會受到環(huán)境和加工條件影響而改變優(yōu)點,廣泛應(yīng)用于動物源成分的鑒定.但常規(guī)PCR需要進行對人體有害的核酸電泳.本實驗以豬牛的線粒體DNA為靶基因設(shè)計引物進行PCR擴增,結(jié)合DHPLC的方法進行肉質(zhì)成分的鑒定.所得的DHPLC的最佳條件為:使用PS-DVB&C18 DNASep色譜柱(4.6 mmX50 mm,粒度3 μm),柱溫為50℃;豬源成分和牛源成分的DHPLC保留時間分別為5.1 min和6.4 min,靈敏度達到1 000 copies核酸.DHPLC方法自動化程度高,設(shè)計程序后可無人值守,特別適用于高通量、快速篩選檢測的需要.該方法的建立提供了一種新的檢測動物源性食品中豬牛源成分的分子診斷技術(shù).

圖3　DHPLC的敏感性檢測結(jié)果

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S852.65+1

B

0529-6005(2016)06-0089-03

2015-04-02

楊娜(1979-),女,碩士,主要從事肉制品摻假鑒別檢測技術(shù)研究,E-mail:tulliper_yang@hotmail.com

徐超,E-mail:xuc06@163.com