抗病毒藥物在動物組織中殘留檢測方法進展

陸　淳,張　鑫,吳劍平,嚴　鳳,顧　欣

(上海市動物疫病預防控制中心,上海長寧201103)

抗病毒藥物在動物組織中殘留檢測方法進展

陸淳,張鑫,吳劍平,嚴鳳,顧欣

(上海市動物疫病預防控制中心,上海長寧201103)

金剛烷類、神經氨酸酶抑制劑、核苷類以及廣譜類的抗病毒藥物都曾被報道用于獸醫臨床治療病毒感染[1],我國農業部2005年發出《關于清查金剛烷胺等抗病毒藥物的緊急通知》要求禁止生產、經營和使用金剛烷胺等抗病毒藥物,美國FDA于2006年禁止金剛烷類和神經氨酸酶抑制劑類抗流感病毒藥物用于禽類,但近年來為預防禽流感,抗病毒藥物在畜禽養殖環節有濫用現象,2012年的"速成雞"事件中檢出雞肉中殘留有金剛烷胺和利巴韋林,給我國家禽養殖業帶來嚴重的負面影響.抗病毒藥物在畜禽養殖業的非法使用屢禁不止,而國內外對動物組織中的抗病毒藥物多殘留的檢測方法研究較少,這給此類藥物的監管帶來了不便,研究建立同時檢測多種抗病毒藥物殘留量的檢測方法,對于有效監控該類藥物的使用、保障我國動物性食品安全具有重要的意義.本文在參考國內外文獻的基礎上,結合自身工作實際,對目前常見四類8種抗病毒藥物殘留的LC/MS/MS檢測方法進行綜述,為監測部門提供參考.

1　抗病毒藥物的分類和機理

抗病毒藥在某種意義上說是病毒抑制劑,不能破壞病毒體,也不會損傷宿主細胞.抗病毒藥的作用在于抑制病毒的繁殖,使宿主免疫系統抵御病毒侵襲,修復被破壞的組織,緩和病情使之不出現臨床癥狀.本文關注的8種常用的抗病毒藥物分類及其作用機理各不相同.

1.1金剛烷胺類抑制病毒復制初期的藥物,阻斷病毒基因的脫殼即阻斷病毒核酸進入宿主細胞,達到治療和預防病毒感染疾病的目的,常見的有:金剛烷胺(Amantadine,ATD),金剛乙胺(Rimantadine,RTD),美金剛胺(Memantine,MMT)等.

1.2神經氨酸酶抑制劑類神經氨酸酶是流感病毒顆粒表面的一種由蛋白構成的酶,是病毒復制和擴散所最關鍵的酶,通過抑制神經氨酸酶的活性,阻止子代病毒顆粒在宿主細胞的復制和釋放,可明顯縮短流感的持續時間,如奧司他韋(Os?eltamivir,OSTV)等.

1.3核苷類在病毒復制過程中,藥物競爭性地與病毒DNA聚合酶或RNA聚合酶相結合,從而抑制酶活性,干擾病毒核酸的合成,產生抗病毒作用,常見的有:利巴韋林(Ribavirin,RBV),阿昔洛韋(Acy?clovir,ACLV),更昔洛韋(Ganciclovir,GCLV)等. 1.4廣譜抗病毒類對流感病毒等多種病毒增殖期的各個環節都有作用,如嗎啉胍(Moroxy?dine,MXD)等.

2　抗病毒藥物的化學性質

抗病毒藥物的水溶性(LogS)、水油分配系數(LogP)、解離系數(pKa)的理論值見表1,8種抗病毒藥物的水溶性和酸堿性不同,其中金剛烷胺、金剛乙胺和美金剛胺的性質接近,均為極性中等,堿性化合物,易溶于甲醇和酸性水溶液,可在反相色譜柱上保留:利巴韋林、阿昔洛韋和更昔洛韋為兩性化合物,極性較大,易溶于水溶液,難在反相色譜柱上保留:嗎啉呱為堿性化合物,易溶于水,難在反相色譜柱上保留:奧司他韋為兩性化合物,易溶于甲醇,可在反相色譜柱上保留.

表1　8種抗病毒藥物的溶解度參數及解離系數

3　抗病毒藥物在動物體內的殘留情況

不同的抗病毒藥物在體內的代謝途徑及代謝產物均不相同,總體來看,8種抗病毒藥物在動物體內均有原型存在,但含量高低不同.金剛烷胺90%以原型排出,金剛乙胺可產生多種代謝產物,包括間羥基化代謝物、2個對羥基代謝物的差向異構體,以及它們與葡萄糖醛酸的結合物等[2-3].利巴韋林在動物體內以原藥、單磷酸酯(RMP)、二磷酸酯(RDP)和三磷酸酯(RTP)等形式存在,其中以原型和RMP的代謝形式占多數[4-5].阿昔洛韋、更昔洛韋主要以原型經腎排泄.嗎啉胍可廣泛分布于雞的體液與組織,主要是在肝臟中進行乙酰化形成無活性的代謝產物,經腎排泄[6].奧司他韋在胃腸道被迅速吸收,經肝臟或腸壁酯酶迅速轉化為活性代謝產物奧司他韋羧酸鹽,至少75%的口服劑量以活性代謝產物、少量以原型的形式進入體內循環.

有學者[12]討論了利巴韋林的原型及代謝物的檢測方法,發現酶解后雞肉中利巴韋林殘留量上升,本課題組將0.1%利巴韋林以飲水方式飼喂雞兩周,在雞肉中檢出較高濃度的利巴韋林原型,作為畜禽養殖禁用藥,檢出原型即可滿足監管要求,因此在實際監測工作中,可不采用酶解,簡化檢測步驟,節省工作時間.

4　抗病毒藥物殘留的前處理方法

抗病毒藥物的作用機理和理化性質各異,傳統前處理方法具有一定選擇性,藥物回收率不一致,且動物組織中藥物殘留量低,經過復雜的提取凈化去脂步驟后,回收率不高,目前的文獻報道[7-12]檢測雞肉中的抗病毒藥物殘留的方法多局限與某一類抗病毒藥物,對多種抗病毒藥物殘留的同時檢測報道較少,通常采用直接提取法、QuEChERS法、固相萃取柱法、固相萃取柱串聯法、柱切換法等進行檢測.其中直接提取法雜質去除不夠充分、QuEChERS法對部分藥物有吸附,柱串聯法、在線凈化法等是比較新穎的思路,值得探索.

4.1直接提取法目前在動物組織中金剛烷胺類殘留量的檢測方法主要采用直接提取法[7-8].本課題組使用酸性水溶液或酸性乙腈直接提取可以提取出所有藥物,但稀釋倍數較大,酸性乙腈提取后可氮吹濃縮,濃縮倍數增加的同時,基質干擾也較大,因此對于多殘留檢測,直接提取法并不適用.

4.2QuEChERS法QuEChERS法是基于固相萃取和基質固相分散技術的快速前處理方法,近期在獸藥殘留分析領域有較多應用,有學者將其用金剛烷胺和氟喹諾酮類的同時提取凈化,取得較好效果[9].本課題組嘗試將其用于8種抗病毒藥物的同時提取,發現在酸性乙腈直接提取的基礎上加入C18粉和PSA會使基質得到凈化,但同時導致藥物回收率有一定降低.

4.3固相萃取柱法采用SPE小柱可實現多種抗病毒藥物的同時提取凈化,并在凈化和濃縮方面均有較好效果[13],但問題的關鍵在于難以將金剛烷類和核苷類同時獲得較好的分析[14],且8種藥物的性質差異較大,因此選用單一固相萃取柱無法將全部藥物都保留.

4.4固相萃取柱串聯法有學者[15]嘗試了HLB固相萃取柱和PBA固相萃取柱串聯使用,通過反相保留機理,將大部分中等極性和非極性的物質保留在HLB柱上,目標分析物利巴韋林在HLB上不保留,進而流過HLB柱,在PBA柱上發生萃取吸附作用,進而實現了凈化和富集,該思路適用于目標較單一的藥物殘留分析.本課題組[16]通過考察不同固相萃取柱對藥物的保留和吸附性質,利用MCX和Hypercarb可分別實現對部分藥物的富集凈化的特性,將MCX固相萃取柱和Hypercarb固相萃取柱串接使用,實現了對8種抗病毒藥物的同時富集凈化,取得較好的效果.

4.5在線凈化法有學者[10]采用甲醇-1%三氯乙酸或乙腈提取動物源食品中金剛烷胺,提取液用陽離子交換在線凈化柱(Cyclone MCX)凈化,5%氨水-甲醇溶液將分析物洗脫轉入至Capcell Pak MG C18分析柱,經色譜分離后,用串聯質譜檢測,取得較好回收率,但對于多種抗病毒藥物殘留分析的適用性有待考察.

綜上,由于8種抗病毒藥物的性質差異較大,傳統的、單一的方法難以實現同時提取、分析,可考慮采用固相萃取柱串聯法,充分去除基質干擾,并使得溶劑能夠匹配LC/MS/MS的檢測.

5　抗病毒藥物殘留檢測的儀器方法

國外有學者[17]在使用SXC固相萃取柱串接PBA固相萃取柱對雞肉進行凈化后,通過在線的柱切換使得7種目標藥物分別在C18色譜柱和石墨化碳Hypercarb色譜柱上保留,實現多種抗病毒藥物的同時分析.綜合文獻報道,本課題組比較了4種色譜體系:親水色譜柱(HILIC)、反相色譜柱(HSS T3)、正相色譜柱(BEH Amide)、石墨化碳色譜柱(Hypercarb),采用不同的色譜柱和流動相體系,會影響藥物的保留時間、出峰順序、響應值等,在反相柱體系中,利巴韋林和阿昔洛韋保留不佳,在1.2 min出峰,易受雜質峰干擾:在親水色譜柱和正相色譜柱體系中金剛烷胺,金剛乙胺,美金剛胺,嗎啉胍,奧司他韋均在1.5～1.8 min出峰,易受雜質峰干擾:在石墨化碳色譜柱體系中獲得了較滿意結果.

6　結論

我國禁止生產、經營和使用抗病毒藥物用于畜禽養殖,抗病毒藥物的種類繁多,作用機理各不相同,代謝物形式較多,殘留在動物體內的抗病毒藥物及其代謝物對人類健康造成隱患,目前抗病毒藥物的殘留檢測是畜禽產品質檢領域的難點和熱點問題,本文綜述了基于LC/MS/MS對多種抗病毒藥物同時檢測的方法,發現問題的難點在于:(1)動物組織中8種藥物的同步提取,固相萃取柱串聯法是目前最好的解決方法;(2)8種藥物在色譜柱上保留和分析,Hypercarb色譜柱能實現對藥物的較好保留;(3)動物組織中的抗病毒藥物殘留形態較多,可將原型作為檢測目標以簡化操作.

通過深入分析了解抗病毒藥物的性質和檢測方法,為實現對抗病毒藥物在畜產品質量領域的有效監控、杜絕抗病毒藥物的非法使用提供技術支持.

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0529-6005(2016)06-0066-03

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上海市市級農口系統青年人才成長計劃[滬農青字(2014)第2-5號];上海市科技興農重點攻關項目[滬農科攻字(2013)第6-9號]

陸淳(1959-),男,高級獸醫師,本科,研究方向為獸藥及飼料檢測,E-mail:m13032160666@163.com

張鑫,E-mail:xin_zh@yeah.net