黑山羊源野牛平腹盤吸蟲ITS2基因序列測定及分析

梅雪芳,楊　磊,陶　立,李　健,黃維義,王冬英

(1.廣西大學動物科學技術學院,廣西南寧530005;2.廣西大學食品質量與安全研究中心,廣西南寧530005;3.廣西獸醫研究所,廣西南寧530001)

黑山羊源野牛平腹盤吸蟲ITS2基因序列測定及分析

梅雪芳1,2,楊磊1,2,陶立3,李健1,2,黃維義1,2,王冬英1,2

(1.廣西大學動物科學技術學院,廣西南寧530005;2.廣西大學食品質量與安全研究中心,廣西南寧530005;3.廣西獸醫研究所,廣西南寧530001)

對首次分離自黑山羊的野牛平腹盤吸蟲(Homalogaster paloniae)進行初步的形態學觀察,擴增其核糖體內第二間隔轉錄區基因序列(the second internal transcribed spacer,ITS2)并測序,獲得的序列經DNAStar軟件處理和人工校對后,得到其精確的ITS2基因序列,長度為295 bp,上傳至GenBank后獲得的登錄號為KJ561151.測序結果經對比分析后顯示與分離自印度的野牛平腹盤吸蟲(GU133056)ITS2基因片段序列一致性為100%.與分離自日本的野牛平腹盤吸蟲(AB042190)ITS2基因序列一致性為99%,僅在第69個位點出現差異.

黑山羊;野牛平復盤吸蟲;ITS2

近年來隨著市場對黑山羊需求的增加,廣西的黑山羊養殖業發展迅速,但寄生蟲病長期阻礙草食獸的養殖.野牛平腹盤吸蟲是寄生在牛羊的盲腸的一種同盤類吸蟲(也稱作前后盤吸蟲),分布于亞洲各地[1],我國眾多省份均有分布記載[2].野牛平腹盤吸蟲的自然終末宿主為黃牛、水牛、山羊和綿羊等,Islam[3]等人報道,水牛感染野牛平腹盤吸蟲后出現盲腸充血、淤血和嚴重的卡他性腸炎等癥狀.此前未見黑山羊感染該吸蟲的報道,本次從廣西某黑山羊養殖場的死亡黑山羊中分離該蟲,進行形態學觀察鑒定后對其核糖體內轉錄第二間隔區(internal transcribed spacer region 2,ITS2)序列進行測定并分析,為今后該蟲引發的疾病進行分子診斷提供了合適的分子標記.

1　材料與方法

1.1蟲體來源2010年剖檢某黑山羊養殖場死亡黑山羊1頭,從其盲腸處檢獲數條腸吸蟲,將3蟲體使用5%福爾馬林液壓片后,保存于10%福爾馬林液中,其余蟲體觀察后均直接保存于70%乙醇中,備用.

1.2主要試劑卡紅(Sigma公司);Taq DNA聚合酶、PCR試劑、DNA標志物(DL-2 000)和pMD18-T載體,均購自寶生物工程(大連)有限公司;DNA提取試劑盒(DNeasy Blood&Tissue kit),購自德國Qiagen公司;膠回收試劑盒,購自天根生化科技(北京)有限公司;人工胃蛋白酶,購自美國Sigma公司.

1.3方法

1.3.1鹽酸卡紅染色觀察吸蟲形態取出保存于10%福爾馬林液的蟲體2條,按孔繁瑤[4]記述的鹽酸卡紅染色法對吸蟲進行染色,透明后使用中性樹膠進行封片,置于顯微鏡下對吸蟲的內部器官形態進行觀察,并拍照.

1.3.2PCR擴增與測序取單條蟲體,按照DNA提取試劑盒使用說明書提取蟲體基因組DNA,依據Goswami[5]等的研究設計的引物,用以擴增野牛平腹盤吸蟲的ITS2基因序列.上游引物(3S):5′-GG?TACCGGTGGATCACTTCGGCTCGTG-3′;下游引物(28R):5′-GGGATCCTGGTTAGTTTCTTTTCCTCCGC-3′),回收擴增產物,經pMD18-T載體克隆后送上海英駿生物技術有限公司測序.

1.3.3序列分析測序結果經DNAStar軟件校正處理,于NCBI進行BLAST分析(http://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi).

2　結果

2.1蟲體形態觀察對封片標本進行觀察發現,其形態構造與陳心陶[2]描述的野牛平腹盤吸蟲相同,據此將本次在黑山羊盲腸中分離到的吸蟲鑒定為野牛平腹盤吸蟲,本文對其形態不作贅述(見中插彩版圖1).

2.2蟲體ITS2基因測序結果PCR擴增野牛平腹盤吸蟲ITS2基因,產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析,所獲得的條帶約為500 bp,與預期的目的片段一致.測序后獲得的序列經人工校正后獲得野牛平腹盤吸蟲精確的ITS2片段,大小為295 bp,GC含量為52%.提交至GenBank后獲得登錄號為KJ561151.

2.3序列分析結果測序結果經對比分析后結果顯示與分離自印度的野牛平腹盤吸蟲(GU133056) ITS2基因片段序列一致性為100%.與分離自日本的野牛平腹盤吸蟲(AB042190)ITS2基因序列一致性為99%,在第69個位點出現差異.

3　討論

野牛平腹盤吸蟲隸屬于腹殖目(Digenea)同盤總科(Paramphistomoidea)腹盤科(Gastrodisci?dae)平腹屬(Homalogaster)[6].此前由于同盤類吸蟲蟲體較肥厚,不便于進行常規的染色觀察,分類鑒定工作較為繁雜,現今可通過分子生物學的方法選擇合適的分子標記可彌補這一不足.吸蟲的ITS2基因序列現被認為是分子鑒定吸蟲種類時可信度最高的序列工具,已在同盤類吸蟲的分子鑒定中得到運用[7].本文通過對黑山羊源的野牛平腹盤吸蟲ITS2基因序列進行擴增測序分析,進一步支持了ITS2在吸蟲的分子鑒定中是合適的分子標記.

圖2　野牛平腹盤吸蟲ITS2基因擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳分析

[1]Yamaguti S.System Helminthum Vol.1.The digenetic trematode of verterbrates[M].New York,Interscience,1958:971-972.

[2]陳心陶.中國動物志吸蟲綱復殖目(一)[M].北京:科學出版社,1985:230-231.

[3]Islam S,Chakraborty A,Das M.Pathological studies of caecum in concurrent infection of Homalogaster paloniae and Schistosoma in?dicum in bovine[J].Journal of Veterinary Parasitology,1990,4 (1):45-48.

[4]孔繁瑤.家畜寄生蟲學[M].2版.北京:中國農業大學出版社,1997:378.

[5]Goswami L M,Prasad P K,Tandon V,et al.Molecular Character?ization Of Gastrodiscoides hominis(Platyhelminthes:Trematode: Digenea)Inferred From ITS Rdna Sequence analysis[J].Parasitology Research,2009,104(6):1485-1490.

[6]Gibson D I,Jones A,Bray R A.Keys to the Trematode,Volume 2 [M].London:CABI Publishing and The Natural History Museum,2002:5-20;221-227;325-336.

[7]李健,全琛宇,石云良,等.食蟹猴體內瓦氏瓦特松吸蟲ITS序列測定及其種系發育分析[J].國際醫學寄生蟲病雜志,2013,6(40):305-310.

Thesequencing and analysis ofHomalogaster paloniaeITS2 geneisolated from black goat

MEI Xue-fang1,2,YANG Lei1,2,TAO Li3,LI Jian1,2,HUANG Wei-yi1,2,WANG Dong-ying1,2
(1.College of Animal Science and Technology,Guangxi University,Nanning 53005,China;2.Research Center of Food Quality and Safety,Guangxi University,Nanning 530004,China;3.Guangxi Veterinary Research Institute,Nanning 530004,China)

We observed the morphology of the Homalogaster paloniae isolated from black goat of Guangxi,and then amplified and sequenced the second internal transcribed spacer.The sequence were analyzed by softwares of DNAstar and checked by artifi?cial.Then,we acquired the accurate ITS2 sequence,and its length was 295 bp.We submitted the sequence to the GenBank and the accession number was KJ561151.Compared with the Homalogaster paloniae isolated from India and Japan,we found that the homology were 100%and 99%,respectively.The sequence had one mutation at the 69 th point when compared with the parasite isolated from Japan.

Black goat;Homalogaster paloniae;ITS2

s:LI Jian;HUANG Wei-yi;WANG Dong-ying

S858.27

A

0529-6005(2016)06-0031-02

2014-09-16

梅雪芳(1990-),女,碩士生,研究方向為預防獸醫,E-mail:384280442@qq.com

李健,E-mail:leejianshin@163.com;黃維義,E-mail: wyhuang@gxu.edu.cn;王冬英:E-mail:dywang@gxu.edu.cn