蜜蜂幼蟲血淋巴營養成分差異可能影響狄斯瓦螨的寄主選擇

王　星,吳艷艷,周　婷,劉進祖,賈慧茹,代平禮,王　強,潘　丁,徐書法

(1.北京市蠶業蜂業管理站,北京西城100029;2.中國農業科學院蜜蜂研究所農業部授粉昆蟲生物學重點開放實驗室,北京海淀100093;3.北京工商大學食品學院環境科學與工程系,北京海淀100048)

蜜蜂幼蟲血淋巴營養成分差異可能影響狄斯瓦螨的寄主選擇

王星1,吳艷艷2,周婷2,劉進祖1,賈慧茹2,代平禮2,王強2,潘丁3,徐書法2

(1.北京市蠶業蜂業管理站,北京西城100029;2.中國農業科學院蜜蜂研究所農業部授粉昆蟲生物學重點開放實驗室,北京海淀100093;3.北京工商大學食品學院環境科學與工程系,北京海淀100048)

本研究著重從狄斯瓦螨依賴度極高的食物著手,較全面地比較了4種蜜蜂幼蟲血淋巴中與螨繁殖高度相關的營養物質含量差異.結果顯示,對狄斯瓦螨吸引力(繁殖力)最弱的中華蜜蜂工蜂幼蟲血淋巴中,蛋白質含量顯著低于其他3種幼蟲,而游離氨基酸含量顯著高于其他3者;對狄斯瓦螨吸引力(繁殖力)最高的中華蜜蜂雄蜂幼蟲血淋巴中,Cu元素和維生素E(生育酚)含量是4種幼蟲中最高的,分別與其他3者具有顯著性差異.研究結果證實,與螨繁殖相關的營養成分含量的差異與螨寄生特性具有高度一致性,這為進一步分析螨的營養需求和尋求從營養上抑制螨繁育的方法打下良好的基礎.

狄斯瓦螨;血淋巴;寄主選擇

狄斯瓦螨是困擾養蜂業生存發展最嚴重的寄生蟲害[1].狄斯瓦螨對于寄主的選擇具有明顯的偏好性.排除中華蜜蜂清理能力的因素,狄斯瓦螨更偏好寄生并繁殖于東方蜜蜂的雄蜂幼蟲,與此相比,對西方蜜蜂的工蜂和雄蜂幼蟲的寄生偏好略低(此兩者相近),而東方蜜蜂的工蜂幼蟲對狄斯瓦螨的吸引力最弱[2].

東方蜜蜂對螨的抗性主要是在長期的協同進化中產生的[3],螨的存在會激發東方蜜蜂強烈的清理行為[4],這可能與蜂房信息素的存在相關.還有研究表明,蜜蜂幼蟲封蓋歷期、巢房大小和新舊程度[5-7]、蜜蜂保幼激素含量[5]、化學信息素等[8]都會影響螨的繁殖能力.

狄斯瓦螨對其寄主血淋巴中營養成分依賴程度非常高,其生命活動所需的物質、能量都源自其寄主(蜜蜂的幼蟲或成蜂)的血淋巴[9-10],所以我們推測狄斯瓦螨對不同蜂種不同職能蜂寄生的偏好和繁殖能力的差異可能與不同幼蟲血淋巴中營養物質含量的差異有關[11].基于此推測,我們分別測定了西方蜜蜂和東方蜜蜂的工蜂和雄蜂幼蟲血淋巴中與繁殖高度相關的蛋白質、游離氨基酸、游離脂肪酸、海藻糖、無機元素和維生素E的含量,并進行了差異比較.

1　材料與方法

1.1蜜蜂品種及產地意大利蜜蜂和中華蜜蜂,產自北京密云縣,兩個蜂場相距約25 km.

1.2蜜蜂幼蟲日齡選擇選取10日齡的大幼蟲.因為狄斯瓦螨進入蜜蜂幼蟲巢房后,在封蓋后60 h后開始產卵,此前為狄斯瓦螨進入蜂房后準備繁殖的關鍵時期,所以剛封蓋幼蟲的血淋巴營養成分對狄斯瓦螨的繁育至關重要.

1.3蜜蜂幼蟲血淋巴抽取方法將幼蟲背面朝上置于干凈濾紙上,用拇指和食指繃緊幼蟲的表皮,以昆蟲針輕輕刺破幼蟲背面靠頭的部位(避開消化道,且刺的不要過深),當血淋巴呈滴狀滲出時用自制的針頭狀毛細管吸取.將毛細管中的蜜蜂幼蟲血淋巴吹入加有少量苯基硫脲的1.5 mL離心管中.因為血淋巴極易氧化,故此操作在冰浴條件下進行,并于-20℃或-70℃保存.

1.4蛋白質測定方法Bradford法(考馬斯亮藍法),本試驗使用了蛋白質測定試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司E111-01/02),蜜蜂幼蟲血淋巴稀釋10倍后測定.

1.5游離氨基酸測定方法將蜜蜂幼蟲血淋巴用5%磺基水揚酸稀釋10倍,充分混勻,離心機10 000 r/min離心10 min,析出沉淀物,取上清液直接使用氨基酸自動分析儀進行測試.

1.6游離脂肪酸測定方法總游離脂肪酸含量采用銅試劑比色法,使用試劑盒(蘇州科銘生物技術有限公司,PW1,50T/48S),進行測定.

1.7海藻糖測定方法蒽酮比色法,使用試劑盒定前需稀釋100倍.

1.8微量元素測定方法Cu、Zn、Se、Mn 4種元素使用電感耦合等離子體質譜法進行測定,工作參數:霧化氣流量:0.96 L/min;輔助氣流量:1.80 L/min;等離子體氣流量:15.0 L/min;駐留時間: 100 ms;樣品提升量:1 mL/min;掃描方式:單點跳峰;分辨率:0.7～0.9 aum.

P、Fe、Mg、Na、K、Ca 6種元素使用等離子體發射光譜法進行測定,工作參數:功率:1 150 KW;冷卻氣:15 L/min;輔助氣:0.5 L/min;載氣:0.2 Mpa;垂直觀測高度:12 mm.

1.9維生素E測定方法高效液相色譜法測定. 1.10數據統計方法指標3組重復,數據采用平均值±SEM表示,并通過單因素方差分析(oneway ANOVA)和Scheffe法進行比較(P<0.05).

2　結果與分析

本試驗對中華蜜蜂工蜂(ACW)、中華蜜蜂雄蜂(ACD)、意大利蜂工蜂(AMW)、意大利蜂雄蜂(AMD)幼蟲的血淋巴中營養物質含量進行了比較測定.結果如下.

2.1蛋白質和游離氨基酸測定結果對32種常見游離氨基酸的含量進行了測定,結果顯示,中華蜜蜂的雄蜂與意大利蜜蜂的工蜂、雄蜂幼蟲血淋巴中蛋白質和氨基酸的含量都比較接近(分別為2996±0.099,2.807±0.100 μg/μL和2.509±0.147 μg/μL),但是中華蜜蜂的工蜂幼蟲血淋巴中蛋白質的含量(1.691±0.114 μg/μL)顯著低于其他3種幼蟲(P<0.001),而游離氨基酸的總含量則顯著高于其他3種幼蟲(P=0.034),尤其是蘇氨酸(P= 0.002)、甘氨酸(P=0.001)、丙氨酸(P<0.001)、異亮氨酸(P<0.001)、苯丙氨酸(P<0.001)和氨基丁酸(P<0.001)的含量遠高于其他3種幼蟲,這可能是在中華蜜蜂工蜂幼蟲發育階段中大量蛋白質水解導致的.

2.2游離脂肪酸測定結果在4種幼蟲血淋巴內,AMW游離脂肪酸含量最高(481.20±32.6 μmol/L),與其他3種幼蟲對應含量具有顯著性差異(P< 0.001),其中:AMD游離脂肪酸含量327.07±25.7 μmol/L,ACW游離脂肪酸含量78.95±5.32 μmol/L,ACD對應含量最低,為60.15±4.90 μmol/L.

2.3海藻糖測定結果試驗結果顯示,ACW和ACD幼蟲血淋巴中海藻糖含量相近且較高,分別達到0.61±0.032 mg/L和0.60±0.04 mg/L,而AMD和AMW對應值相近且較低(分別為0.52±0.01 mg/L和0.52±0.02 mg/L);中華蜜蜂幼蟲(ACW和ACD)血淋巴中海藻糖濃度顯著高于意大利蜜蜂幼蟲(AMW和AMD)(P<0.05).

2.4微量元素測定結果對10種重要微量元素進行了檢測,結果顯示,ACD幼蟲Cu含量和ACW幼蟲Zn含量是4種幼蟲中最高的,分別與其他3者具有顯著性差異;AMW幼蟲Fe含量、AMD幼蟲K含量ACW幼蟲Na含量和ACW幼蟲Se含量是4種幼蟲中最低的,同樣與其他3者具有顯著性差異;Ca、Mg和P在4種幼蟲中含量相近,不具有顯著性差異.

表1　4種蜜蜂幼蟲血淋巴中微量元素含量對比(單位:μg/g)

2.5維生素E測定結果維生素E是對動物生殖具有重要作用的維生素,分別對3種維生素E的同分異構體(維生素E-α、δ和γ)進行了含量測定,結果顯示,ACD的維生素E總含量最高,達到6.08±0.41 μg/mL,顯著高于其他3種幼蟲(P< 0.001),其中:ACW血淋巴中維生素E含量為1.74±0.10 μg/mL,AMW血淋巴中維生素E含量為1.12±0.06 μg/mL AMD血淋巴中維生素E含量為1.23±0.09 μg/mL.

3　討論

蛋白質是構成細胞的基本有機物,是生命活動的主要承擔者,氨基酸則是合成蛋白質所需的最基本物質,兩者都是生物體所需的重要營養物質.曾有研究表明,狄斯瓦螨體內沒有蛋白水解酶,直接利用寄主血淋巴蛋白,不需前期消化;也可以利用寄主血淋巴蛋白進入卵母細胞,促進卵子發育;第一若蟲也直接利用寄主的蛋白.由此,我們推測蛋白質對于螨的繁殖和其他生命活動更加重要,對氨基酸的利用率并不太高.由于中華蜜蜂工蜂幼蟲血淋巴蛋白質含量偏低(同時因為蛋白質的分解導致了游離氨基酸含量高),不足以提供狄斯瓦螨繁殖所需的蛋白質營養,所以導致狄斯瓦螨自然感染條件下在中華蜜蜂工蜂房中不育,而人工侵染條件下其在中華蜜蜂工蜂房中繁殖率偏低.

在能源物質方面,游離脂肪酸(FFA)是重要的能量代謝物質,與動物的持久運動能力有關,從試驗結果來看,同蜂種的工蜂幼蟲比雄蜂幼蟲血淋巴游離脂肪酸含量高,而意大利蜂幼蟲的血淋巴游離脂肪酸含量要比中華蜜蜂游離脂肪酸含量高很多(3～5倍),造成這一現象的原因還不清楚,可能跟蜂種發育過程中的脂類物質和能量代謝不同有關,推測這可能是造成意大利蜂飛行和采集能力較強的原因之一.昆蟲血淋巴中含有高濃度的海藻糖,這是昆蟲血淋巴的重要生化特征,也是昆蟲抗寒能力的重要指標.本研究顯示,中華蜜蜂幼蟲血淋巴中海藻糖的濃度明顯高于意大利蜂,所以血淋巴中的高濃度海藻糖含量可能是中華蜜蜂比意大利蜂更耐寒的原因之一.綜上分析,蜜蜂幼蟲血淋巴中的主要能源物質含量差異對螨的寄生繁殖能力的差異方面看不出相關性.

在微量物質方面,包括微量無機元素和維生素等,經過多次預試驗,我們發現不同產地的4種蜜蜂幼蟲血淋巴中微量物質的變化是很大的,這可能跟不同地區的蜜源植物不同有關,蜜蜂采集的花蜜和花粉不同,所獲得的微量物質也有顯著的差別.但令我們感興趣的是,多個產地的蜜蜂幼蟲,其血淋巴中銅離子和維生素E的差異趨勢是基本相同的,試驗結果顯示,中華蜜蜂的雄蜂幼蟲血淋巴中與繁殖能力密切相關的銅元素和維生素E含量均顯著高于其他3個蜜蜂幼蟲,這與螨寄生的差異性顯示出高度的一致性,即螨在自然侵染條件下,對中華蜜蜂雄蜂幼蟲更具偏好性,在人工侵染蜜蜂幼蟲條件下,在中華蜜蜂的雄蜂房內繁殖率更高.目前對狄斯瓦螨的營養發育研究還非常有限,但是通過對其依賴性極高的食物(蜜蜂幼蟲血淋巴)組分分析,發現其中與繁殖相關的重要營養物質與狄斯瓦螨的寄生能力差異存在著高度相關性,所以,我們推測蜜蜂幼蟲血淋巴組分的差異極有可能導致狄斯瓦螨的寄生偏好性,影響其對寄主的選擇.當然,這一結論還需要今后更多的試驗來證實.我們今后開展的研究工作期望能夠發現對螨的繁殖起關鍵作用的營養元素需求量和底限,或者能夠找到抑制螨繁殖的關鍵因素,從而從營養學角度找到控制螨繁殖的方法.

表2　中華蜜蜂幼蟲血淋巴組分含量特征與意大利蜂螨繁殖能力的相關比較

[1]Ting Zhou,Denis L.Anderson,Zachary Y Huang,et al.Identifi?cation of Varroa mites(Acari:Varroidae)infesting Apis cerana and Apis mellifera in China[J].Apidologie,2004(35):645-654.

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Thedifferenceof thenutritional components in hemolymph of honeybee larva may affected thehost preferenceofVarroa destructor

WANG Xing1,WU Yan-yan2,ZHOU Ting2,LIU Jing-zu1,JIA Hui-ru2,DAI Ping-li2,WANG Qiang2,PAN Ding3,XU Shu-fa2
(1.Beijing apiculture and sericulture station,Beijing 100029,China;2.Key Laboratory of Pollinating Insect Biology of Ministry of Agriculture,Institute of Apicultural Research,Chinese Academy of Agricultural Science,Beijing 100093,China;3.Environmental Science and Engineering,School of Food and Chemical Science,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China)

The varroa destructor a parasite for honey bee is the top threaten to the beekeeping industry world widely.Previous studies have demonstrated that the propensity of Varroa destructor to its hosts is different,implying that the difference of nutritional components in hemolymph of honeybee larvas may affect the host preference of Varroa destructor.In this study,larvas of both work?ers and drones from two bee species,Apis cerana and Apis mellifera,were included.The nutrients related with Varroa destructor re?production were compared.Our data indicated the protein level of Apis cerana worker larva was significantly lower than the others,while amino acids were higher.Moreover,free fatty acid level in Apis mellifera worker larva,was the highest.Cu content and Vita?min E in Apis cerana drone,as well as Zn in Apis cerana worker larva,were the highest in all the four types.In conclusion,our data confirmed that nutritional components from different bee larva were highly consistent with host preference of Varroa destructor.Our findings will be beneficial for analyzing the nutritional requirement for mites of Varroa destructor and preventing the mite reproduc?tion by nutritional control manner.

Varroa destructor;Hemolymph;host preference

XU Shu-fa

S895

A

0529-6005(2016)06-0010-03

2015-09-09

國家科技支撐項目(2011BAD33B04);國家自然科學基金項目(31101772)

王星(1980-),男,工程師,碩士,從事蜂業行業管理工作,E-mail:150488276@qq.com

吳艷艷(1984-),女,助理研究員,博士,從事蜜蜂病害研究工作,E-mail:mifeng9876@163.com

注:吳艷艷與王星對本文具有同等貢獻

徐書法,E-mail:xushufa@caas.cn