2014年華南地區(qū)PRRSV ORF5基因的遺傳變異分析

鄧勝朝,馮嘉萍,崔　進,陳 耀,崔甜甜,白小磊,石慶偉,張桂紅

(華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院,廣東廣州510642)

2014年華南地區(qū)PRRSV ORF5基因的遺傳變異分析

鄧勝朝,馮嘉萍,崔進,陳 耀,崔甜甜,白小磊,石慶偉,張桂紅

(華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院,廣東廣州510642)

為了研究華南地區(qū)PRRSV的遺傳變異情況,本研究對2014年華南地區(qū)16份PRRSV陽性樣品的ORF5基因進行了RT-PCR擴增、克隆和測序,并將其進行序列比對和遺傳進化分析.結果表明:本研究檢測的16株PRRSV ORF5基因的核苷酸同源性為82.8%～100%,與JXA1,CH-1a以及VR2332核苷酸同源性分別為84.4%～99.3%,85.9%～ 95.0%和83.6%～89.2%.遺傳進化樹分析顯示,所獲得16株毒株序列中有13株屬于以JXA1為代表的變異株亞群,另外3株屬于以GM2,QYYZ為代表的新分支亞群.GP5氨基酸位點分析發(fā)現(xiàn)新分支亞群存在較為廣泛的變異,尤其在信號肽區(qū),誘導表位,中和表位及高變區(qū).

豬繁殖與呼吸障礙綜合征;華南地區(qū);ORF5;遺傳變異

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),是一種由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種急性接觸性傳染病,以母豬發(fā)熱、流產、胎兒木乃伊化、產死胎、弱仔等繁殖障礙和仔豬呼吸道癥狀為主要特征,是目前世界上對養(yǎng)豬業(yè)帶來重大經濟損失的一種傳染性疾病.目前,PRRSV主要分為兩種基因型,分別為以LV為代表株的歐洲型(EU)及以VR2332為代表株的美洲型(NA),我國主要流行株為美洲型[1].

PRRSV屬于套式病毒目(Nidovirales),動脈炎病毒科(Arteriviridae),動脈炎病毒屬(Arterivirus),基因組全長約15 kb,包含10個開放性閱讀框(ORFs),即ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5a、ORF5、ORF6和ORF7.ORF5編碼的糖蛋白GP5是PRRSV最主要的保護性抗原蛋白,具有受體識別作用和誘導細胞凋亡的功能.在所有結構蛋白中,GP5蛋白遺傳變異性最大[2],常用于作為流行病學監(jiān)測的標志性蛋白.通過了解華南地區(qū)2014年ORF5基因的遺傳進化關系,對于華南地區(qū)PRRS的防控提供參考依據(jù).

1　材料與方法

1.1病料樣品2014年,在華南不同地區(qū)的不同養(yǎng)殖場采集疑似PRRSV樣品(肺臟、肝臟、腎臟、淋巴結、血清等),經RT-PCR檢測為陽性的樣品中選取16份進行研究分析.

1.2主要試劑RNA酶抑制劑、dNTP、Ex Taq DNA聚合酶、M-MLV,以及pMD18-T Vector,均購自TaKaRa公司;TRIZol Reagent,購自Invitrogen公司;DNA凝膠回收試劑盒,購自Omega公司;隆宿主菌E.coli DH5α由華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院農業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點實驗室保存.

1.3樣品RT-PCR鑒定將約2.0 g組織樣品用生理鹽水研磨成1∶5的組織勻漿,反復凍融3次后離心取上清液,參照TRIZol LRS Reagent總RNA提取試劑的使用說明書提取病毒總RNA,進行RT-PCR鑒定.

1.4ORF5基因的擴增與測序根據(jù)GenBank中發(fā)表的PRRSV基因組序列,設計擴增PRRSV ORF5基因的引物ORF5-F:5′-TGAGACCATGAGGTGGGC-3′,ORF5-R:5′-GAAAACGCCAAAAGCACC-3′PCR,按照以下反應條件為:94℃5 min,1個循環(huán);94℃1 min,53℃30 s,72℃1 min,30個循環(huán);最后72℃延伸10 min.進行PCR擴增,瓊脂糖凝膠回收性產物,并克隆至pMD18-T載體中,連接產物轉化DH5α感受態(tài)細胞,挑取單個菌落,進行PCR鑒定,陽性重組菌液送往上海英駿生物技術有限公司進行序列測定.

1.5基因序列遺傳進化分析應用DNAStar和Mega5.0對擴增的核苷酸序列與從GenBank中選取的參考毒株的序列進行同源性比較,繪制系統(tǒng)進化樹,并將所測序列登錄至GenBank序列庫.

2　結果

2.12014年華南地區(qū)PRRSV樣品檢測結果2014年,由華南地區(qū)不同養(yǎng)殖場疑似PRRSV樣品中檢測到的陽性樣品中,按照采集地點和時間不同選取16株進行ORF5基因序列分析.

2.2PRRSV ORF5基因的同源性和遺傳進化分析對16株序列ORF5氨基酸和核苷酸同源性分析結果表明,2014年毒株之間的ORF5的核苷酸同源性達到82.8%～100%,與參考序列比較發(fā)現(xiàn)這16株毒株與變異株JXA1,HuN4,TJ株,歐洲型代表株LV,北美型代表株VR2332,以及中國經典代表毒株CH-1a的ORF5核苷酸同源性分別在84.4%～99.3%,84.4%～99.5%,84.4%～99.3%,62.1%～64.5%,83.6%～89.2%,85.9%～95.0%范圍.ORF5進化樹分析結果表明,所有毒株均屬于美洲型毒株,同時所分離毒株與參考毒株又進一步分為4個大的分支:分別為以JXA1為代表的高致病性毒株的亞群(第1亞群),以中國經典株CH-1a為代表的亞群(第3亞群),以美洲型疫苗株VR2332為代表的亞群(第4亞群),以及以2012年報道的GM2和QYYZ為代表的新分支亞群(第2亞群).本研究16株毒株中13株主要分布于以JXA1為代表的高致病性毒株亞群,剩下的3株(14ZS3,14ZS9和14DG)獨立分布于以GM2,QYYZ為代表的新分支亞群,GM2和QYYZ為2012年報道的弱毒疫苗與野毒重組的新型重組毒株(圖1).

2.3PRRSV ORF5氨基酸位點分析根據(jù)不同區(qū)域(包括信號肽區(qū)1-26aa,誘導表位(A/V) VLV,中和表位PNE,37H(F/L)QLIYNL45,高變區(qū),轉膜區(qū),以及細胞表位)對ORF5氨基酸位點突變分析,發(fā)現(xiàn)不同亞型的毒株表現(xiàn)出不一樣的突變情況,而第2亞群表現(xiàn)出最為廣泛的突變,突變位點分布在信號肽區(qū),高變區(qū)(aa32-40),誘導表位,中和表位以及細胞表位(圖2).在第二亞群(疫苗和野毒重組亞群),出現(xiàn)廣泛的突變位點,包括信號肽區(qū)(C10G,Y24C,L25S,A26I),誘導表位(V27A),HVR1(S32N,N33G,N35S),中和表位(H38Y,I39S),TM1(T66C),TM2(Y101F),T細胞表位(L117F,L152I,E161I),以及B細胞表位(L189V,R191K,R199H,L200P)均出現(xiàn)同一突變,其中在信號肽區(qū)(C10G,Y24C),HVR1(N35S),TM2(Y101F),T細胞表位(E161I),以及B細胞表位(L200P)出現(xiàn)與第4亞群(以VR2332疫苗株為代表的亞群)相同的突變位點.另外,不同亞群之間糖基化位點數(shù)也存在差異,第1亞群中,包括4個糖基化位點,而在第2亞群只有3個糖基化位點.

3　討論

根據(jù)ORF5核苷酸同源性分析結果表明,2014年所測毒株ORF5的核苷酸序列同源性分別達到82.8%～100%,與JXA1的同源性最高,為84.4%～ 99.3%,初步表明2014年華南地區(qū)主要流行株與高致病性毒株具有較高的親緣關系.進化樹分析結果顯示,16株毒株中的13株主要分布于以JXA1為代表的高致病性毒株亞群,剩下的3株獨立分布于以GM2,QYYZ為代表的新分支亞群,GM2和QYYZ為2012年報道的弱毒疫苗與野毒重組的新型重組毒株.目前華南地區(qū)主要流行毒株為高致病性毒株,野毒重組的新型重組毒株的出現(xiàn)表明華南地區(qū)毒株亞型的多樣性.在第2亞群中,GM2為2012年報道QYYZ與RespPRRSMLV疫苗株的重組株[3].有大量文章報道,在華南地區(qū)疫苗的大量使用可能會存在弱毒苗的毒力返強或者疫苗毒與野毒的重組現(xiàn)象,同時大量使用疫苗對病毒產生較強的免疫壓力,加速病毒的進化趨勢[3-5].此外,本實驗室有研究17株全長序列分析表明潛在的疫苗株返強的可能[6].近年所報道的出現(xiàn)新的額外缺失毒株如BL2,QY2010,NVDC-GD2,GDQY2,GDQJ等毒株均分離于廣東地區(qū)[7-10].

圖1　基于PRRSV ORF5基因的遺傳進化分析

圖2　PRRSV GP5氨基酸位點變異性分析

第2亞群的ORF5氨基酸位點在不同區(qū)域均表現(xiàn)出大量的變異,其中信號肽區(qū)(C10G,Y24C),HVR1(N35S),TM2(Y101F),T細胞表位(E161I),以及B細胞表位(L200P)出現(xiàn)與第四亞型相同的突變位點,說明疫苗的廣泛使用可能導致疫苗株的返強或者重組高變異株的暴發(fā)[11-13].有研究表明,R13Q和R151G是病毒弱化的標志,在第2亞群中的3個毒株中,14DG僅存在一個突變R13Q,14ZS3和14ZS9在該兩個位置均有突變R13H和R151K,但該亞群中的毒株是否為強毒株還需進行進一步的監(jiān)測[12].有研究表明,糖基化位點的增加會導致聚糖屏蔽作用,作為一種免疫逃避機制.第2亞群中僅存在的糖基化位點比第1亞群少,在缺乏糖鏈的保護作用且處在較高的免疫壓力選擇下,導致第2亞群的ORF5氨基酸不同區(qū)域的位點出現(xiàn)大量突變[14].

圖3　PRRSV GP5氨基酸位點變異性分析

綜合結果說明,華南地區(qū)大量高致病性毒株的存在,以及疫苗株與野毒株重組毒新亞群的出現(xiàn)充分表明,華南地區(qū)PRRSV流行毒株的多樣性、高變異性以及復雜性.本研究結果為華南地區(qū)對于PRRSV的防控提供一定的參考.

[1]朱佳毅,任曉峰.豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測方法的研究進展[J].中國預防獸醫(yī)學報,2014,36(1):77-80.

[2]Liu Jian-kui,Wei Chun-hua,Yang Xiao-yan,et al.Genetic di?versity and evolutionary characterization of Chinese porcine repro?ductive and respiratory syndrome viruses based on NSP2 and ORF5[J].Arch Virol,2013,158(1/2):1811-1816.

[3]Lu W H,Wei Z Y,Zhang G Q,et al.Complete Genome Sequence of a Novel Strains between Vaccine and Wild-Type PRRSV Strain: Evidence for Recombination Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus(PRRSV)Variant[J].JVirol,2012,86(17):9543.

[4]Liu D,Zhou R,Zhang J,et al.Recombination analyses between two strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in vivo[J].Virus Res,2011 2:473-486.

[5]Li Y,Wang X,Jiang P,et al.Genetic variation analysis of por? cine reproductive and respiratory syndrome virus isolated in Chi?na from 2002 to 2007 based on ORF5[J].Vet Microbiol,2009,138(1-2):150-155.

[6]Zhang M,Xie J,Sun L,et al.Phylogenetic Analysis and Molecu?lar Characteristics of 17 Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Isolates in Southern China From 2010 to 2011 [J].Microb Pathog,2013,65:67-72.

[7]黃元,禹思宇,宣華,等.PRRSV廣東變異株分離及Nsp2部分序列分析[J].動物醫(yī)學進展,2011(03):26-31.

[8]Deng Y,Pan Y,Wang D,et al.Complete Genome Sequence of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Strain QY2010 Reveals a Novel Subgroup Emerging in China[J].J Virol,2012,86(14):7719-7720.

[9]Wang F X,Song N,Chen L Z,et al.Non-Structural Protein 2 of the Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome(PRRS)Vi?rus:A Crucial Protein in Viral Pathogenesis,Immunity and Diag?nosis[J].Res Vet Sci,2013,95(1):1-7.

[10]Zhou F,Liang S,Chen A H,et al.A Transgenic Marc-145 Cell Line of piggyBac TraNsposon-Derived Targeting shRNA Interfer?ence Against Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Vi?rus[J].Vet Res Commun,2012,36(2):99-105.

[11]Shang Y,Wang G,Tian H,et al.Molecular Epidemiological In?vestigation of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Vi?rus in Northwest China From 2007 to 2010[J].Virus Genes,2012,45(1):90-97.

[12]Zhou L,Chen S,Zhang J,et al.Molecular Variation Analysis of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus in China [J].Virus Res,2009,145(1):97-105.

[13]Zhang H Y,Liang J J,Meng X M,et al.Molecular Epidemiology of PRRSV From China's Guangxi Province Between 2007 and 2009[J].Virus Genes,2013,46(1):71-80.

[14]Vigerust D J,Shepherd V L.Virus glycosylation:role in virulence and immune interactions[J].Trends Microbiol,2007,15:211-218.

Genetic variation and phylogenetic analysis of ORF5 geneof PRRSV in Southern China in 2014

DENG Sheng-chao,FENG Jia-ping,CUI Jin,CHEN Yao,CUI Tian-tian,BAI Xiao-lei,SHI Qing-wei,ZHANG Gui-hong
(College of Veterinary Medicine,South China Agriculture University,Guangzhou 510642,China)

To analyze the genetic variation of PRRSV in South China,a total of 16 PRRSV positive samples were collected from different breeding farms in Southern China in 2014,and the ORF5 genes were amplified by RT-PCR,cloned and sequenced. The results of alignment analysis showed that all of the ORF5 of the 16 strains had 82.8%～100%nucleotide identity to each oth?er,and exhibited 84.4%～99.3%,85.9%～95.0%and 83.6%～89.2%homology with JXA1,Ch-1a and VR2332,respectively. Phylogenetic analysis based on the ORF5 gene indicated that 13 of 16 strains were closely related to the JXA1 strain and belonged to subgroup I,and the other 3 strains were closely related to the new branch of GM2 and QYYZ strains isolated in 2012 which be?longed to subgroup II.ORF5 phylogenic analysis revealed that the extensive mutations existed in this subgenotype of the new branch,especially in the signal peptide,induced epitopes,neutralizing epitopes,and hypervariable regions.

ZHANG Gui-hong

S852.65

A

0529-6005(2016)06-0003-04

2015-04-09

現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項資金資助(CARS-36)

鄧勝朝(1989-),男,碩士生,主要從事動物病毒分子生物學研究,E-mail:shengchaod@126.com

張桂紅,E-mail:guihongzh@126.com