慢性阻塞性肺疾病合并認知功能障礙患者外周血單核細胞TREM2表達及意義

王耀煒，王惠芳

(西安醫學院第二附屬醫院，西安710038)

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慢性阻塞性肺疾病合并認知功能障礙患者外周血單核細胞TREM2表達及意義

王耀煒，王惠芳

(西安醫學院第二附屬醫院，西安710038)

目的觀察慢性阻塞性肺疾病(COPD)合并不同程度認知功能障礙患者外周血單核細胞(PBMC)中髓系細胞觸發受體2(TREM2)表達水平，并探討其臨床意義。方法選擇COPD穩定期患者81例，其中無認知障礙19例(A組)，輕度認知障礙22例(B組)，中度認知障礙21例(C組)，重度認知障礙19例(D組)。分別采用RT-PCR法和流式細胞儀檢測PBMC中的TREM2 mRNA及蛋白，采用 3.0 T 超導磁共振成像系統測定雙側海馬總體積。結果TREM2 mRNA及蛋白表達量A組0.05。相關性分析顯示，TREM2 mRNA及蛋白表達均與雙側海馬總體積呈負相關(r分別為-0.582、-0.463，P均<0.05)。結論COPD合并不同程度認知功能障礙患者PBMC中TREM2表達增加，其可能在COPD患者發生認知障礙的過程中起重要作用。

慢性阻塞性肺疾??；認知障礙；髓系細胞觸發受體2；外周血單核細胞；海馬體積

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種以氣道慢性炎癥為核心并伴有全身炎癥反應的氣流受限不完全可逆的常見肺部疾病。研究顯示，COPD患者存在明顯的認知功能障礙，且隨著肺功能的惡化認知障礙程度進一步加重，嚴重者可發展至阿爾茨海默病(AD)[1]。髓系細胞觸發受體2(TREM2)是新近發現的免疫球蛋白超家族受體，多表達于單核巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞等。最近研究表明，TREM2過度表達可增加AD發病風險，與編碼TREM2的基因突變相關[2]。人的海馬是雙側結構，位于大腦半球內，與注意力、記憶力等認知功能密切相關。既往對COPD合并認知障礙患者外周血單核細胞(PBMC)是否表達TREM2，以及其表達變化是否與認知障礙相關的研究報道較少。本研究觀察了TREM2基因在COPD合并認知障礙患者PBMC中的表達及規律，初步探討其作用機制，為防治COPD合并認知功能障礙奠定基礎。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇2013年1月～2015年3月西安醫學院第二附屬醫院收治的COPD穩定期患者81例，男74例、女7例，年齡68～85(71.5±6.0)歲，病程(24.5±6.0)年。入選標準：①符合中華醫學會呼吸病學分會2007 年制定的《慢性阻塞性肺疾病診治指南》中的診斷標準。②病情穩定，無急性感染。③高中以上文化程度。④排除腦重要部位(額葉、顳葉)梗死，甲狀腺功能低下，嚴重軀體疾病或精神類疾病、慢性酒精中毒、肺性腦病、嚴重肝病、肝性腦病、低血糖反應、糖尿病酮癥等與認知障礙相關的疾病。就診當日簡易精神智能評定量表(MMSE)評估，無認知障礙(MMSE≥27)19例(A組)，輕度認知障礙(21≤MMSE<27)22例(B組)；中度認知障礙(10≤MMSE<20)21例(C組)，重度認知障礙(MMSE<9)19例(D組)。4組臨床資料具有可比性，入選者均知情同意。

1.2PBMC的分離采集受試者清晨空腹肘靜脈血3 mL，加入單核細胞分離液，參照文獻[3]方法提取PBMC。

1.3PBMC中TREM2 mRNA檢測采用RT-PCR法。按試劑盒說明書提取總RNA，測定總RNA的濃度和純度，使A260/A280值>1.8后行一步法cDNA反轉錄反應。取cDNA 4 μL配制PCR反應溶液，依次加入模板引物和Tap酶至總反應體系20 μL，置于PCR擴增儀上進行PCR反應。TREM2 mRNA的PCR條件：94 ℃ 2 min，然后94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環；擴增片段長度為120 bp。β-actin的PCR條件：94 ℃ 3min，94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，30個循環；擴增片段長度為123 bp。最后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，Marker和各組PCR產物上樣量均為5 μL，得到目的基因和內參的條帶；經凝膠成像分析系統掃描后，以目的基因與內參的光密度(OD)值表示TREM2 mRNA的相對表達量。TREM2 mRNA和內參β-actin的引物序列由本實驗室設計，上?；瞪锕竞铣?。TREM2 mRNA擴增引物及熒光探針：上游引物為5′-TGGTCAGAGGGCTGGACTGT-3′，下游引物為5′-TCCTGGCTGGACTTAAGCTGTAG-3′，熒光探針為5′-FAM-ATTCTCTCACGTACCTCCGGGTCCAGTG-MGB-3′；β-actin擴增引物及熒光探針：上游引物為5′-AGCGGTTCCGATGCCCT -3′，下游引物為5′-AGAGGTCTTTACGGATGTCAACG-3′，熒光探針為5′-FAM-CCTTCCTTCTTGGGTATGGAATCCTGTG-BHQ1-3′。

1.4PBMC中TREM2蛋白檢測采用流式細胞儀(BD公司)檢測，CellQuest軟件分析。首先通過大鼠抗小鼠TREM2多克隆抗體與單核細胞表面TREM2受體蛋白結合，再用異硫氰酸基熒光素(FITC)標記的山羊抗大鼠IgG二抗與多克隆抗體結合；上機通過流式細胞儀檢測FITC的量，最后得出平均熒光強度,用此間接表示細胞膜表面TREM2蛋白表達量。

1.5雙側海馬總體積測算應用美國GE公司3.0 T超導磁共振成像系統對入選者進行頭部掃描，在ADM4.4圖像處理工作站分析測算雙側海馬總體積。為排除顱腔體積對海馬體積大小的影響，根據公式(Vs=Vp×Cn/Ct)對海馬體積進行標準化處理。其中Vs為標準化后海馬體積，Vp為原始海馬體積，Cn為個體顱腔體積，Ct為全體受試對象顱腔體積。

2　結果

2.1各組PBMC中TREM2 mRNA及蛋白表達比較TREM2 mRNA及蛋白表達量A組

2.2各組雙側海馬總體積比較A～D組雙側海馬總體積分別為(8.36±0.63)、(7.23±0.56)、(4.02±0.34)、(3.86±0.35)cm3，C、D組與A、B組比較P均<0.05，A、B組間與C、D組間比較，P均>0.05。

表1　各組PBMC中TREM2 mRNA及蛋白表達比較

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，△P<0.05。

2.3TREM2表達與雙側海馬總體積的關系相關性分析顯示，TREM2 mRNA及蛋白表達均與雙側海馬總體積呈負相關(r分別為-0.582、-0.463，P均<0.05)。

3　討論

COPD常呈進行性發展，主要累及肺臟，也可導致肺外器官的損害，如神經系統受損。認知功能損害在COPD患者中普遍存在[4]，已經成為臨床重點關注的問題。既往研究認為，缺氧是導致認知功能障礙的首要原因，另外慢性炎癥、二氧化碳潴留、肺功能進行性下降等均可導致認知障礙逐漸加重[5]。認知障礙是癡呆的高危因素。Li等[6]發現，與普通人相比，COPD患者患老年癡呆癥的概率明顯增加。Villeneuve等[7]發現，有輕度認知障礙的患者有一半在3年內發展為癡呆。2006年的一項研究表明，認知障礙是COPD患者死亡的獨立危險因素[8]，以慢性缺氧及系統性炎癥為特征的COPD患者或許是AD的一種亞臨床表現。

TREM2是表達于髓系細胞膜表面的先天性免疫受體，屬于免疫球蛋白超家族成員之一。最新研究顯示,TREM2基因突變與多種神經退行性疾病存在相關性。Borroni等[9]報道，TREM2 Q33X、R47H、T66M、S116C等位點在有額顳癡呆的患者中存在明顯突變，而健康人中未發現。Rosenthal等[10]報道，TREM2參與了老年癡呆癥的發病過程，與編碼TREM2的基因上的罕見變異相關。Guerreiro等[11]報道，TREM2在腦組織中廣泛表達，在腦白質、海馬和新皮層中呈高表達，而在小腦中呈低表達。

認知是機體認識并獲得知識的加工過程，主要包括學習、語言、記憶、思維以及精神情感等一系列心理和社會行為。MMSE量表是目前最常用的認知障礙篩查量表，有較高的敏感性和準確性[12]。人類認知功能的形成非常復雜，海馬與人類的注意力、記憶力、抽象概括力等認知功能密切相關[13]。本研究采用3.0 T超導磁共振成像技術測量COPD合并認知障礙患者雙側海馬總體積，初步研究外周血單核細胞TREM2表達變化與海馬總體積變化的關系，為將來此類患者認知障礙的防治提供依據。

本研究結果顯示，TREM2 mRNA及蛋白表達量A組

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