低分子殼聚糖對缺氧復氧大鼠心肌細胞的保護作用

林玲輝，衛茹，胡亞平，王卓，李迎娟

(邢臺醫學高等專科學校，河北邢臺054300)

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低分子殼聚糖對缺氧復氧大鼠心肌細胞的保護作用

林玲輝，衛茹，胡亞平，王卓，李迎娟

(邢臺醫學高等專科學校，河北邢臺054300)

目的 探討低分子殼聚糖(LMCTS)對缺氧復氧大鼠心肌細胞的保護作用，并探討其作用機制。方法原代培養大鼠心肌細胞，將其分為空白對照組、模型組及低、中、高LMCTS組。空白對照組正常培養，不予任何處理；模型組用真空缺氧處理1 h后復氧24 h；低、中、高LMCTS組分別加入含200、400、600 μg/mL LMCTS的培養液，培養24 h后再用真空缺氧處理1 h后復氧24 h。ELISA法測定各組細胞上清液中炎癥因子TNF-α、IL-6，Western blot法檢測心肌細胞解偶聯蛋白-2(UCP-2)表達。結果 低、中、高LMCTS組心肌細胞存活率均較模型組升高(P均<0.01)。模型組心肌細胞上清液中TNF-α、IL-6水平高于空白對照組(P均<0.01)，低、中、高LMCTS組均低于模型組，以高LMCTS組最低(P均<0.01)。模型組心肌細胞UCP-2表達較空白對照組升高，低、中、高LMCTS組較模型組降低，以高LMCTS組最低(P均<0.01)。結論LMCTS對缺氧復氧心肌細胞具有保護作用，其機制與抑制炎癥反應、降低UCP-2表達有關。

殼聚糖；缺氧復氧；解偶聯蛋白-2；心肌細胞；大鼠

低分子殼聚糖(LMCTS)是一種天然的帶正電荷的生物高分子線形多糖，是殼聚糖降解后的產物，有較高的溶解度，易被吸收和利用。研究表明，殼聚糖具有降血脂、降血壓、降血糖、抗腫瘤、抗脂質過氧化、調節免疫等多種特性，廣泛用于醫學各領域[1～3]。缺氧復氧損傷指心肌細胞在缺氧復氧過程中產生各種氧自由基，對細胞膜及生物大分子造成過氧化損傷，破壞細胞膜的正常結構，對心肌細胞造成嚴重損傷[4]。2014～2015年，我們觀察了LMCTS對缺氧復氧大鼠心肌細胞的保護作用，及其對解偶聯蛋白-2(UCP-2)表達的影響，探討LMCTS保護大鼠心肌細胞的機制。

1　材料與方法

1.1材料出生72 h內的清潔級Wistar大鼠，雌雄不限，由邢臺醫學高等專科學校實驗動物中心提供。LMCTS購于濟南海得貝海洋生物工程有限公司；UCP-2大鼠單克隆抗體購自Abcam公司；羊抗鼠IgG購于天津三箭生物技術有限公司；Alexa Fluor 488標記的羊抗鼠IgG抗體購自沃特司生物系統有限公司；UCP-2引物購自上海生工公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；第1鏈cDNA合成試劑盒購于北京全式金生物技術有限公司；RIPA裂解液、TRIzol、胰蛋白酶、青鏈霉素混合溶液均購于北京鼎國昌盛生物技術有限公司；胎牛血清為GIBICO公司產品；高糖DMEM培養基購于賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司。

1.2大鼠原代心肌細胞培養取大鼠心臟，剪成1 mm3大小的組織塊，加入胰蛋白酶消化，加入PBS，離心棄上清。加入DMEM培養基制成細胞懸液，再加入10%胎牛血清和1%青-鏈霉素溶液。差速貼壁90 min后，小心吸出未壁貼細胞懸液至新的培養皿中培養。

1.3大鼠缺氧復氧模型的建立取培養72 h的大鼠心肌細胞，饑餓處理24 h后，隨機分成空白對照組、模型組和低、中、高LMCTS組預處理組，每組設6個復孔，空白對照組正常培養，不予任何處理；模型組用真空缺氧處理1 h后復氧24 h；低、中、高LMCTS組分別加入含200、400、600 μg/mL LMCTS的培養液，培養24 h后，再用真空缺氧處理1 h后復氧24 h。

1.4心肌細胞活力測定采用MTT比色法。細胞計數后在96孔板上以1×104/孔接種細胞。每孔加入20 μL MTT溶液，繼續培養4 h，吸出培養液。每孔加入二甲基亞砜(DMSO)100 μL，室溫低速震蕩30 min充分溶解。酶標儀測定各孔在570 nm波長的吸收值。細胞存活率=(實驗組光吸收值/對照組光吸收值)×100%。

1.5細胞上清中TNF-α、IL-6水平檢測采用ELISA法。收集各組細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書操作，最后使用酶標儀檢測TNF-α、IL-6。

1.6心肌細胞UCP-2蛋白表達檢測采用Western blot法。將各組細胞用200 μL RIPA裂解液裂解，用干凈的細胞刮將細胞迅速刮下，轉移至1.5 mL的EP管中，冰上裂解30 min，離心取上清，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質濃度。SDS-PAGE電泳，濃縮膠80 V恒壓，分離膠160 V恒壓，將蛋白轉移至醋酸纖維素膜上。TBST溶液洗膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，洗膜3次，再用UCP-2抗體(1∶1 000)室溫搖床上孵育2 h，加入羊抗鼠IgG抗體(1∶1 000)室溫孵育2 h，加入ECL顯色液，多功能成像系統顯影。以各組UCP-2蛋白的灰度值與內參GAPDH的灰度值之比作為UCP-2蛋白的相對表達量。

2　結果

2.1各組心肌細胞存活率比較空白對照組、模型組及低、中、高LMCTS組細胞存活率分別為100%±1%、67%±39%、70%±29%、78%±7%、89%±2%。模型組細胞存活率較空白對照組降低，低、中、高LMCTS組均較模型組升高(P均<0.01)。

2.2各組心肌細胞上清液中TNF-α、IL-6水平比較模型組心肌細胞上清液中TNF-α、IL-6水平高于空白對照組(P均<0.01)，低、中、高LMCTS組均低于模型組，以高LMCTS組最低(P<0.01)。見表1。

表1　各組心肌細胞上清液中TNF-α、IL-6水平比較(n=6，pg/mL)

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與空白對照組比較，#P<0.05。

2.3各組心肌細胞UCP-2蛋白表達比較空白對照組、模型組及低、中、高LMCTS組心肌細胞UCP-2蛋白的相對表達量分別為1.00±0.01、1.50±0.10、1.49±0.12、1.30±0.03、1.06±0.04。模型組心肌細胞UCP-2表達較空白對照組顯著升高；中、高LMCTS組均較模型組降低，且以高LMCTS組最低(P均<0.01)。

3　討論

缺氧復氧損傷可引起心律失常、急性心力衰竭及心源性休克等，白細胞和許多炎癥因子直接參與或間接調動更多炎癥介質導致心肌損傷。研究證實，殼聚糖能通過提高SOD活性，降低MDA含量，提高體內抗氧化酶的活性，降低脂質氧化含量，增強機體抗氧化應激能力；抑制腹主動脈再狹窄，在一定范圍內具有調節血管平滑肌細胞和血管成纖維細胞增殖的能力[5]。趙英政等[6]報道，殼聚糖可顯著提高鎘中毒大鼠腎組織中SOD活性并降低MDA含量。瞿春瑩等[7]報道，殼聚糖能增強抗氧化酶活性，減輕胃潰瘍局部炎癥介導的氧自由基損傷，進而促進潰瘍愈合。袁菊萍等[8]報道，殼聚糖能降低MDA水平，升高SOD活性，提高其對體內氧化自由基的清除能力，減少脂質過氧化物生成。高穎暉等[9]測定負荷訓練結束后大鼠肝臟的抗氧化酶系活性時，發現補充殼聚糖能顯著增強大鼠肝臟抗氧化酶活性，促進SOD編碼基因表達。

UCP-2是一種哺乳動物獨有的、位于線粒體內膜上的質子載體蛋白，其將H+從線粒體內膜滲漏到基質中，使氧化磷酸化解偶聯，導致ATP合成減少。UCP-2廣泛分布于骨骼肌、脂肪、心、肺、腎、肝、腦，與機體能量代謝、心臟功能等有密切聯系[10]。研究表明，UCP-2在調控ROS、抑制炎癥反應和細胞凋亡等方面均可發揮重要作用。Koziel等[11]發現，UCP-2能減少大鼠心肌ROS產生，降低細胞內Ca2+濃度，對細胞起到保護作用。Derdak等[12]發現，UCP-2能通過抑制NF-κB的產生，減少炎癥介質的釋放和ROS的生成而保護心肌。還有研究表明，UCP-2能抑制平滑肌細胞的增殖和遷移，并防止內皮細胞和心肌細胞凋亡[13，14]。殼聚糖對大鼠心肌細胞的保護作用是否與UCP2表達有關，目前未見文獻報道。

本研究顯示，與空白對照組相比，模型組心肌細胞培養上清液中TNF-α、IL-6水平顯著增高，表明心肌細胞缺氧復氧損傷可引起明顯的炎癥反應。不同濃度LMCTS處理后可顯著降低缺氧復氧心肌細胞培養上清液中TNF-α、IL-6水平，表明LMCTS能夠抑制炎癥反應，且濃度越高，其抑制炎癥反應的作用越明顯。在正常心肌細胞中，UCP-2呈低水平表達；在缺氧復氧誘導的無LMCTS預處理的心肌細胞損傷模型中，UCP-2表達明顯升高；而LMCTS對缺氧復氧損傷心肌細胞UCP-2表達均具有抑制作用，其中以600 μg/mL LMCTS作用最明顯。表明LMCTS對缺氧復氧心肌細胞具有保護作用，該作用與其抑制炎癥反應、降低UCP-2表達有關。

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河北省高等學校科學研究項目(QN2014303)。

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R541.2

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1002-266X(2016)22-0033-03

2015-11-25)