Notch信號報告系統(tǒng)在前列腺腫瘤細(xì)胞系中的建立

秦麗霞，崔劍，申海蓮，高維強

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院，上海200127)

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Notch信號報告系統(tǒng)在前列腺腫瘤細(xì)胞系中的建立

秦麗霞，崔劍，申海蓮，高維強

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院，上海200127)

目的在前列腺腫瘤細(xì)胞系LNCaP中建立Notch信號報告系統(tǒng)。方法采用In-Fusion酶系統(tǒng)將巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子和Notch蛋白胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(ICD)細(xì)胞核內(nèi)DNA結(jié)合蛋白CSL的8拷貝串聯(lián)DNA序列克隆入pLVX-acGFP-N1慢病毒載體，構(gòu)建Notch信號報告重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒(pLVX-8XCSL-acGFP)。在人胚腎293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pLVX-8XCSL-acGFP質(zhì)粒或?qū)φ召|(zhì)粒pLVX-acGFP，6 h后再轉(zhuǎn)染Notch受體的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(NICD)的表達(dá)質(zhì)粒pETP-NICD(過表達(dá)NICD)或?qū)φ召|(zhì)粒pETP。轉(zhuǎn)染48 h后用熒光顯微鏡觀察GFP的表達(dá)，用流式細(xì)胞儀進行熒光定量分析。然后將pLVX-8XCSL-acGFP質(zhì)粒及對照質(zhì)粒包裝成慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞系LNCaP，72 h后熒光顯微鏡觀察綠色熒光，用流式細(xì)胞儀分選出GFP熒光強度最強5%及最弱5%的細(xì)胞。提取這兩部分細(xì)胞的RNA，采用qRT-PCR方法檢測細(xì)胞中Notch1、Notch2以及Notch信號通路下游靶基因Hey1的表達(dá)。結(jié)果在轉(zhuǎn)染pLVX-8XCSL-acGFP的293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染pETP-NICD的細(xì)胞熒光強度較轉(zhuǎn)染pETP對照質(zhì)粒的細(xì)胞增加了約10倍；而在轉(zhuǎn)染pLVX-acGFP的293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染pETP-NICD的細(xì)胞與轉(zhuǎn)染pETP對照質(zhì)粒的細(xì)胞熒光強度無明顯差異。根據(jù)pLVX-8XCSL-acGFP熒光強度分選出的LNCaP細(xì)胞，熒光強度高的細(xì)胞Notch1、Notch2、Hey1表達(dá)高于熒光強度弱的細(xì)胞(P均<0.05)。結(jié)論在LNCaP細(xì)胞中pLVX-8XCSL-acGFP可以作為報告Notch信號水平的有效工具。

前列腺腫瘤；LNCaP細(xì)胞；人胚腎293T細(xì)胞；Notch基因；信號報告系統(tǒng)

Notch信號通路是一條在生物進化過程中高度保守的信號通路，其通過相鄰的兩個細(xì)胞細(xì)胞膜上的受體和配體相互作用，參與調(diào)控生物體從胚胎到成體組織的眾多發(fā)育過程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中也起重要作用[1，2]。成熟的Notch蛋白為Ⅰ型跨膜蛋白，主要分為胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(ICD)3個部分。當(dāng)Notch受體與細(xì)胞膜表面的配體結(jié)合后，Notch信號通路被激活，隨后受體的ICD被釋放到胞內(nèi)，轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，與DNA結(jié)合蛋白CSL結(jié)合。CSL能夠特異性識別YGTGRGAA DNA序列并與之結(jié)合，當(dāng)沒有ICD與之結(jié)合的時候，CSL作為轉(zhuǎn)錄抑制因子結(jié)合在Notch靶基因的啟動子上，防止Notch靶基因在Notch信號未被激活的情況下隨機轉(zhuǎn)錄。目前對于前列腺腫瘤中Notch信號通路的作用尚無一致性結(jié)論，許多研究結(jié)果相互矛盾。2015年8月～2016年1月，我們通過慢病毒感染在前列腺腫瘤細(xì)胞系LNCaP中建立Notch信號報告系統(tǒng)，旨在為研究Notch信號通路對前列腺腫瘤細(xì)胞的影響打下基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料前列腺細(xì)胞系LNCaP和人胚腎293T細(xì)胞均購于美國菌種保藏中心。RPMI-1640和DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基及胎牛血清購于Gibco公司；jetPRIME DNA轉(zhuǎn)染試劑購于Polyplus公司；mRNA逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR試劑盒購于TAKARA公司；pLVX-acGFP-N1慢病毒載體購自Clontech公司；包裝質(zhì)粒PΔ(pCMV-dR8.8)和pMD2.G為本實驗室保存質(zhì)粒；PETP質(zhì)粒為本實驗室保存質(zhì)粒，PETP-NICD質(zhì)粒為本實驗室自購質(zhì)粒；用于質(zhì)粒構(gòu)建的限制性內(nèi)切酶購于New England Biolabs公司；In-Fusion酶購于Clontech公司；感受態(tài)細(xì)胞DH5α、DNA瓊脂糖膠回收及質(zhì)粒抽提純化試劑盒購于Tiangen公司；Notch1、Notch2及Notch信號通路下游靶基因Hey1的引物及DNA片段合成和質(zhì)粒測序由上海生工公司完成；流式細(xì)胞分析使用BD FACSAriaTM流式細(xì)胞儀。

1.2方法

1.2.1構(gòu)建Notch報告重組慢病毒由華大基因公司合成CCGACTCGTGGGAAAATGGGCGGAAGGG-CACCGTGGGAAAATAGTACCGACTCGTGGGAAAAT-GGGCGGAAGGGCACCGTGGGAAAATAGTACCGAC-TCGTGGGAAAATGGGCGGAAGGGCACCGTGGGAA-AATAGTACCGACTCGTGGGAAAATGGGCGGAAGG-GCACCGTGGGAAAATAGTA的片段，內(nèi)含有8拷貝CSL的結(jié)合位點序列CGTGGGAA。克隆載體選擇為pGL3-promoter。設(shè)計一對引物：正向引物5′-AGATCCAGTTTATCGAGCGGCCGCAATAAAATATC-3′，反向引物5′-CATGACCGGTGGATCCATGGTGGCTTTACCAACA-3′。將CSL結(jié)合序列連同pGL3-promoter上的CMV basic promoter一起擴增出來。對pLVX-acGFP-N1用ClaΙ和BamHΙ酶切。使用Clontech公司的In-Fusion酶將8拷貝的CSL序列及CMV basic promoter序列插入pLVX-acGFP-N1，替換掉pLVX-acGFP-N1載體上自帶的promoter序列，構(gòu)建pLVX-8XCSL-acGFP重組Notch報告慢病毒質(zhì)粒，同時構(gòu)建僅用CMV basic promoter序列替換掉pLVX-acGFP-N1自帶promoter序列的重組pLVX-acGFP慢病毒質(zhì)粒，作為對照質(zhì)粒。通過PCR及測序鑒定，測序結(jié)果正確。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染將293T細(xì)胞加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，LNCaP加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。進行細(xì)胞轉(zhuǎn)染時，先取15×104個細(xì)胞置6孔板中貼壁培養(yǎng)24 h，每孔使用2 μg質(zhì)粒、4 μL轉(zhuǎn)染試劑，按說明書操作。轉(zhuǎn)染后48 h進行相關(guān)檢測。

1.2.3病毒包裝及感染反應(yīng)體系：目的質(zhì)粒9 μg，PΔ(pCMV-dR8.8)6 μg，pMD2.G 3 μg，jetPRIME reagent 36 μL，jetPRIME buffer 500 μL。將293T細(xì)胞置于10 cm培養(yǎng)皿，長至90%時用上述體系按操作說明書進行病毒包裝。分別于培養(yǎng)6、24 h換液，48、72 h收集2次病毒，將病毒濃縮。病毒感染細(xì)胞時加入8 μg/mL聚凝胺提高感染效率。

1.2.4Notch信號強度檢測采用流式細(xì)胞分析。在293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染表達(dá)acGFP報告基因的質(zhì)粒，48 h后收集細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀選取GFP通道并設(shè)置相關(guān)參數(shù)后分析GFP熒光強度。LNCaP細(xì)胞感染pLVX-8XCSL-acGFP質(zhì)粒72 h后，使用流式細(xì)胞儀選取GFP通道并設(shè)置相關(guān)參數(shù)，分選出GFP熒光強度最強5%與最弱5%的兩組細(xì)胞。

1.2.5Notch1、Notch2、Hey1表達(dá)檢測采用qRT-PCR方法。使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用SYBR-Green(TOYOBO)進行實時定量PCR反應(yīng)。qRT-PCR引物序列如下：Notch1上游引物：TGGACCAGATTGGGGAGTTC，下游引物：GCACACTCGTCTGTGTTGAC；Notch2上游引物：CAACCGCAATGGAGGCTATG，下游引物：GCGAAGGCACAATCATCAATGTT；Hey1上游引物：GTTCGGCTCTAGGTTCCATGT，下游引物：CGTCGGCGCTTCTCAATTATTC。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系：SYBR Green 10.0 μL，Primer 2.0 μL，cDNA 2.0 μL，RNase free water 6.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 mins，95 ℃ 15 s。讀取基因擴增的 Ct值，以actin為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達(dá)量。

1.2.6統(tǒng)計學(xué)方法采用Excel軟件，通過GraphPad Prism 5.0作圖并對數(shù)據(jù)進行分析，采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1pLVX-8XCSL-acGFP系統(tǒng)在293T細(xì)胞中的Notch信號特異性293T細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染pLVX-acGFP與pLVX-8XCSL-acGFP質(zhì)粒，48 h后熒光顯微鏡觀察，轉(zhuǎn)染pLVX-acGFP質(zhì)粒的293T細(xì)胞熒光非常微弱，幾乎不可見；轉(zhuǎn)染pLVX-8XCSL-acGFP質(zhì)粒的細(xì)胞熒光強度明顯比轉(zhuǎn)染pLVX-acGFP增強。為了確認(rèn)這種熒光信號具有Notch信號特異性，在pLVX-acGFP與pLVX-8XCSL-acGFP質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞6 h后，再分別轉(zhuǎn)染pETP-NICD(過表達(dá)NICD)和pETP質(zhì)粒，48 h后熒光顯微鏡下觀察。在轉(zhuǎn)染pLVX-8XCSL-acGFP的293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染pETP-NICD的細(xì)胞熒光強度較轉(zhuǎn)染pETP對照質(zhì)粒的細(xì)胞顯著增強，流式細(xì)胞儀檢測其熒光強度分別為1 071±50.680、110±2.517；然而在轉(zhuǎn)染pLVX-acGFP的293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染pETP-NICD的細(xì)胞與轉(zhuǎn)染pETP對照質(zhì)粒的細(xì)胞熒光強度無明顯差異，流式細(xì)胞儀檢測其熒光強度分別為6.333±0.333、5.333±0.333。

2.2LNCaP細(xì)胞Notch信號報告系統(tǒng)的建立情況向LNCaP細(xì)胞轉(zhuǎn)染pLVX-8XCSL-acGFP慢病毒，72 h后熒光顯微鏡下觀察，LNCaP細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光。取熒光強度最強的5%與最弱的5%細(xì)胞株，qRT-PCR方法檢測Notch1、Notch2、Hey1表達(dá)，結(jié)果見表1。

表1　GFP熒光強度最強與最弱的5%細(xì)胞株Notch1、Notch2、Hey1表達(dá)

注：與最強5%比較，*P<0.05。

3　討論

Notch信號通路包含了許多參與細(xì)胞基礎(chǔ)生命活動(如細(xì)胞周期調(diào)控、新陳代謝、細(xì)胞分化等)的基因[2，3]。Notch信號通路與腫瘤的關(guān)系最初于上世紀(jì)90年代在T細(xì)胞急性淋巴白血病(T-ALL)中被報道，在T-ALL中Notch存在著廣泛的激活突變，導(dǎo)致Notch以一種異常形式被激活[4]。但是與血液腫瘤中Notch信號通路具有明顯的癌基因作用不同，Notch在實體瘤中的情況更為復(fù)雜。在不同實體瘤和不同狀態(tài)下，Notch信號通路既可以發(fā)揮促進腫瘤的作用，又可以發(fā)揮抑制腫瘤的作用[5，6]。關(guān)于前列腺腫瘤中Notch信號通路的研究很多，但目前對于Notch信號在前列腺腫瘤中的作用尚無統(tǒng)一結(jié)論。首先，Notch信號通路在永生化的前列腺正常細(xì)胞系和前列腺腫瘤細(xì)胞系中普遍存在，在這些細(xì)胞系中，Notch信號通路元件的表達(dá)差異十分顯著。這種差異提示Notch信號在前列腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。

在前列腺腫瘤細(xì)胞系中，干擾Jag1會通過S期阻滯抑制腫瘤細(xì)胞增殖[7]。干擾Notch1可通過AKT、FoxM1或Bcl-2、Bax抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡[8]。同時，Notch信號還可顯著影響前列腺腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。干擾Notch1后，腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著減低[9]，并且Notch信號通路靶基因Hes1在高轉(zhuǎn)移的前列腺腫瘤細(xì)胞中上調(diào)。在對前列腺腫瘤細(xì)胞耐藥株的研究中發(fā)現(xiàn)，Notch2在抗紫杉醇的耐藥細(xì)胞株中高表達(dá)，用DAPT抑制劑可以使耐藥細(xì)胞株恢復(fù)對紫杉醇化療藥物的敏感性[10]。以上研究提示，Notch信號通路對前列腺腫瘤可能起促進作用。但另外一些研究則顯示，Notch信號通路對腫瘤具有抑制作用，在前列腺細(xì)胞系中過表達(dá)ICD可以抑制LNCaP、PC3、DU145等前列腺腫瘤細(xì)胞增殖[11]；通過PTOV1下調(diào)Notch信號通路的下游靶基因Hey1、Hes1可以促進PC3增殖和侵襲能力[12]；另外，Notch信號通路下游的靶基因Hey1/2和HeyL具有雄激素受體共抑制因子的作用[13]。

最新研究顯示，前列腺腫瘤組織與正常前列腺組織相比，Notch信號通路的各組分表達(dá)情況發(fā)生顯著變化。Notch1在腫瘤組織中顯著降低，但Notch3卻明顯升高，Notch2在腫瘤的各個階段變化不大，Notch4在PIN中特異性高表達(dá)[14]。來自Gene Logic數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)顯示，在前列腺腫瘤中Notch1、Hey1表達(dá)下降[15]。另有研究顯示，Notch1通過調(diào)控PTEN基因的表達(dá)發(fā)揮抑癌基因的作用[16]。但Zhu等[17]報道，Notch1在原發(fā)腫瘤中低表達(dá)，在轉(zhuǎn)移灶中高表達(dá)，認(rèn)為Notch1可能促進腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

由于Notch信號通路在前列腺腫瘤中作用的不確定性，Notch信號通路至今仍未進入前列腺腫瘤的臨床治療。為此,我們構(gòu)建了一個以acGFP為報告基因的Notch信號報告系統(tǒng)。其能夠?qū)崟r反映腫瘤細(xì)胞本身的Notch信號強度及變化，未引入任何其他外源基因的影響。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染pLVX-8XCSL-acGFP的293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染pETP-NICD的細(xì)胞熒光強度較轉(zhuǎn)染pETP對照質(zhì)粒的細(xì)胞增加了約10倍；而在轉(zhuǎn)染pLVX-acGFP的293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染pETP-NICD的細(xì)胞與轉(zhuǎn)染pETP對照質(zhì)粒的細(xì)胞熒光強度無明顯差異。根據(jù)pLVX-8XCSL-acGFP熒光強度分選出的LNCaP細(xì)胞，熒光強度高的細(xì)胞Notch1、Notch2、Hey1表達(dá)高于熒光強度弱的細(xì)胞。表明在LNCaP細(xì)胞中pLVX-8XCSL-acGFP可以作為報告Notch信號水平的有效工具。作為一種在前列腺腫瘤細(xì)胞中實時研究Notch信號通路對腫瘤細(xì)胞影響的有效工具，它可以幫助我們更好地研究Notch信號通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。比如，利用這一系統(tǒng)將異質(zhì)性的前列腺腫瘤細(xì)胞按Notch信號通路的不同強度分開，研究不同Notch信號強度的前列腺腫瘤細(xì)胞惡性程度的差異，觀察前列腺腫瘤細(xì)胞在獲得抗藥性和轉(zhuǎn)移過程中Notch信號通路的變化情況，探討Notch信號通路是否與腫瘤干細(xì)胞存在相關(guān)性等等。

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Establishment of Notch signaling pathway reporter system in prostate cancer cell line

QINLixia,CUIJian,SHENHailian,GAOWeiqiang

(RenjiHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200127,China)

ObjectiveTo establish a Notch signaling reporter system in prostate cancer cell line LNCaP.MethodsWe set up a Notch signaling reporter system by first constructing a lentivirus plasmid (pLVX-8XCSL-acGFP) which containing a tandem of 8 copy transfactor CSL DNA binding elements driven by a CMV promoter. Then the 293T cells were transfected with pLVX-8XCSL-acGFP plasmids for 6 h or with pLVX-acGFP plasmids as a control group, respectively. Furthermore, 293T cells in each of the above group were re-transfected with pETP-NICD or pETP control plasmids. The green fluorescence was observed with fluorescence-microscope at 48 h, and the fluorescence intensity was quantified by flow cytometry. Then, pLVX-8XCSL-acGFP plasmids were packed to produce pLVX-8XCSL-acGFP lentivirus to transduce prostate cancer cell line LnCaP. The green fluorescence was observed under fluorescence-microscope at 72 h. Furthermore, the cells were divided into two groups with flow cytometry according to the fluorescence intensity: the 5% highest intensity group and the 5% lowest group. Then the expression of Notch1, Notch2 and Hey1 were monitored by Q-PCR in both groups. ResultsIn the 293T cells transfected with pLVX-8XCSL-acGFP, the green fluorescence intensity of cells transfected with pETP-NICD was 10 times higher than that of cells transfected with pETP control plasmid, while in the 293T cells transfected with pLVX-acGFP, no significant difference was found in the fluorescence intensity between cells transfected with pETP-NICD and cells transfected with pETP control plasmid. Q-PCR test displayed that the expression of Notch1, Notch2 and Hey1 in the 5% highest fluorescence intensity group were significant higher than that in the 5% lowest intensity group (allP<0.05). ConclusionIn the LNCaP cells, pLVX-8XCSL-acGFP can be used as an effective tool to report Notch signal level.

prostate carcinoma; LNCaP cells; human embryo kidney 293T cells; Notch gene; signaling pathway reporter system

國家自然科學(xué)基金資助項目(81371507)；上海交通大學(xué)多學(xué)科交叉項目培育項目(醫(yī)工YG2013MS40)；上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院科技基金(3XJ10016)。

秦麗霞(1988-)，女，碩士研究生，主要研究方向為腫瘤學(xué)。E-mail: lxqin0905@163.com

簡介：高維強(1958-)，男，教授，主要研究方向為腫瘤的發(fā)生發(fā)展。E-mail: weiqgao@yahoo.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.22.009

R737.25

A

1002-266X(2016)22-0027-04

2016-02-15)