女性非吸煙肺腺癌患者癌組織中miR-93-3p表達與EGFR突變的關(guān)系

王玉，張寰，許芳秀，俞曉，林虹燕，錢碧云,

(1天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，國家腫瘤臨床研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室，天津300060；2中國人民解放軍第401醫(yī)院；3上海交通大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院)

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女性非吸煙肺腺癌患者癌組織中miR-93-3p表達與EGFR突變的關(guān)系

王玉1，張寰1，許芳秀2，俞曉3，林虹燕3，錢碧云1,3

(1天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，國家腫瘤臨床研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室，天津300060；2中國人民解放軍第401醫(yī)院；3上海交通大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院)

目的探討女性非吸煙肺腺癌患者癌組織中表皮生長因子受體(EGFR)突變與miR-93-3p表達的關(guān)系。方法選擇女性非吸煙肺腺癌患者149例，利用實時熒光定量PCR方法檢測其中112例肺腺癌組織中miR-93-3p的相對表達量，應(yīng)用直接測序方法檢測149例肺腺癌組織中EGFR的突變情況；分析miR-93-3p表達與臨床病理特征、EGFR突變及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果肺腺癌組織中miR-93-3p的相對表達量與臨床分期有關(guān)。149例患者中，EGFR野生型78例，突變型71例；EGFR突變型患者的miR-93-3p表達高于野生型患者(P<0.01)。miR-93-3p高表達患者的預(yù)后較miR-93-3p低表達者差，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。分層分析顯示，年齡≤60歲的女性患者中，miR-93-3p高表達者預(yù)后較低表達者差(P<0.05)。結(jié)論EGFR突變患者miR-93-3p表達升高；miR-93-3p可能成為女性非吸煙肺腺癌靶向治療的新靶點，尤其是年輕女性。

非小細胞肺癌；女性；煙草，非吸煙；表皮生長因子受體；miR-93-3p

肺腺癌是女性非吸煙肺癌患者的主要病理類型[1]。既往研究顯示，女性非吸煙肺腺癌患者癌組織中的表皮生長因子受體(EGFR)具有較高的突變率[2]。EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)具有給藥方式簡便、高特異性、無嚴(yán)重不良反應(yīng)等優(yōu)點，是肺癌的主要治療手段，但仍有20%～30%的EGFR突變型肺癌患者使用EGFR-TKI無效[3]。微小核糖核酸(miRNA)是一類內(nèi)源性長度為18～25 nt的單鏈非編碼RNA，它能調(diào)控大約50%的編碼蛋白基因，參與調(diào)控肺癌的發(fā)生發(fā)展過程[4]。研究表明，miR-23a、miR-134在不同EGFR突變中的表達譜存在差異，與EGFR-TKI的治療效果有關(guān)。我們的前期研究對4例女性非吸煙肺腺癌患者進行觀察，發(fā)現(xiàn)miR-93-3p在EGFR突變型和EGFR野生型中的表達存在差異[5]。本研究進一步擴大樣本量，檢測了149例女性非吸煙肺腺癌患者EGFR的突變狀況及女性非吸煙肺腺癌患者癌組織中miR-93-3p的表達，探討miR-93-3p表達與EGFR突變、臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取2007年1月～2013年12月天津腫瘤醫(yī)院收治的女性非吸煙肺腺癌患者149例，年齡28～81歲、平均59歲。均經(jīng)手術(shù)病理或組織活檢確診為原發(fā)性肺腺癌。既往無惡性腫瘤史，術(shù)前未進行新輔助放化療。患者術(shù)后每半年經(jīng)電話隨訪一次，末次隨訪時間為2014年2月。失訪患者的生存時間截止到最后一次隨訪時間，死亡患者的生存時間截止到死亡時間，仍存活患者的生存時間截止到末次隨訪時間。

1.2EGFR突變檢測用酚-氯仿方法提取149例肺腺癌組織DNA。通過PCR方法擴增EGFR的4個外顯子，目的片段PCR產(chǎn)物根據(jù)Ezgene Gel/PCR extraction Kit(BIOMIGA公司，美國)說明書進行純化，通過BigDye測序反應(yīng)試劑盒(Applied Biosystems公司,美國)對純化產(chǎn)物進行測序分析。測序PCR反應(yīng)體系如下：2.5×BigDye 0.25 μL，5×BigDyeSeq Buffer 3.875 μL，3.2 pmol/μL引物1 μL，10 ng/μL純化后PCR產(chǎn)物1 μL，滅菌水13.875 μL，共20 μL。反應(yīng)條件：96 ℃ 1 min；96 ℃ 10 s、55 ℃ 5 s、60 ℃ 4 min，25個循環(huán)。將測序PCR產(chǎn)物純化后進行上樣電泳，用Sequencing Analysis v5.4軟件分析EGFR的突變情況。

1.3肺腺癌組織中miR-93-3p表達檢測采用RT-PCR方法。取112例肺腺癌組織標(biāo)本，使用Trizol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。實時熒光定量PCR反應(yīng)的mix為Taqman universal Master MixⅡ,no UNG(Applied Biosystems公司,美國),miR-93-3p熒光探針由美國Sangon公司合成，反應(yīng)體系：2×mix 2.5 μL, 20×probe 0.25 μL，cDNA 0.5 μL，DEPC水1.75 μL，共5 μL。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，50個循環(huán)(95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min)。每個樣本設(shè)3個復(fù)孔。以RNAU6為內(nèi)參，目的基因miR-93-3p的相對表達量用lg2-ΔΔct表示：Δct=ctmiR-93-3p-ctRNAU6;ΔΔct=Δct-Δctmean。

2　結(jié)果

2.1肺腺癌組織中miR-93-3p表達與臨床病理特征的關(guān)系見表1。

表1　肺腺癌組織中miR-93-3p表達與臨床病理特征的關(guān)系

2.2miR-93-3p表達與EGFR突變的關(guān)系149例患者中，EGFR野生型78例；突變型71例，其中18外顯子突變5例，19外顯子突變27例，20外顯子突變7例，21外顯子突變32例。112例患者中，EGFR突變型肺腺癌組織中miR-93-3p的相對表達量為7.60±0.46，EGFR野生型為7.31±0.42，二者比較P<0.01。根據(jù)臨床分期進行分層分析，Ⅰ、Ⅱ期EGFR突變型肺腺癌組織中miR-93-3p的相對表達量為7.55±0.07，高于EGFR野生型的7.24±0.07(P<0.01)；Ⅲ、Ⅳ期EGFR突變型的肺腺癌組織中miR-93-3p的相對表達量為7.61±0.09，高于EGFR野生型的7.35±0.07(P<0.05)。

2.3肺腺癌組織中miR-93-3p表達對肺癌預(yù)后的影響生存分析顯示，臨床分期是影響預(yù)后的因素(P<0.05)，而年齡、是否有肺部疾病史、是否有腫瘤家族史、EGFR突變狀態(tài)與預(yù)后無關(guān)(P均>0.05)。根據(jù)miR-93-3p在肺腺癌組織中相對表達量的平均值7.46，將患者分為低表達組(相對表達量≤7.46)和高表達組(相對表達量﹥7.46)。Kaplan-Meier生存分析顯示，與低表達組相比，高表達組預(yù)后較差，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.075)，見表2。進一步進行年齡分層分析顯示，年齡≤60歲女性高表達組生存率較低表達組低(P<0.05)，年齡>60歲女性高表達組與低表達組生存率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

表2　患者臨床特征與預(yù)后的關(guān)系

3　討論

研究顯示，我國青年女性人群的肺腺癌發(fā)病率近年來呈持續(xù)上升趨勢。本研究利用直接測序方法檢測女性非吸煙肺腺癌患者癌組織中EGFR的突變情況，結(jié)果顯示EGFR的突變率為47.66%，以19、21外顯子突變最常見，與以往文獻[6]報道一致。

EGFR是一種跨膜受體，由胞膜外配體結(jié)合區(qū)域、單跨膜區(qū)域以及具有酪氨酸激酶(TK)活性的胞質(zhì)區(qū)構(gòu)成。當(dāng)酪氨酸激酶活性區(qū)域即18～21外顯子區(qū)發(fā)生突變時，受體的酪氨酸激酶被活化，引起多個細胞內(nèi)的信號級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[7]。靶向藥物EGFR-TKI通過與ATP競爭EGFR胞內(nèi)區(qū)激酶催化位點，阻斷酪氨酸激酶的活性，抑制腫瘤的生長，可顯著延長患者生存期[8]。但是隨著臨床上的廣泛應(yīng)用，患者對其產(chǎn)生了耐藥性。Yamamoto等[9，10]報道，PTEN表達的缺失和PIK3CA異常突變阻礙了EGFR-TKI誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡，下調(diào)PTEN表達可促進肺癌細胞增殖。miRNA與EGFR-TKI的耐藥機制相關(guān)。Li等[11]報道，miR-21在EGFR-TKI耐藥性細胞株P(guān)C9GR中高表達，除此之外，miR-200a、miR-23a都被發(fā)現(xiàn)與EGFR-TKI耐藥有關(guān)[12，13]。

圖1　年齡分層分析miR-93-3p表達對肺腺癌生存率的影響

miR-93屬于miR-106b-25基因家族，可通過抑制多個腫瘤相關(guān)蛋白的表達，調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。有研究表明，miR-93通過下調(diào)PDCD4的表達，抑制胃癌細胞的凋亡[14]。Lin等[15]研究發(fā)現(xiàn)，miR-93能夠抑制抑癌基因FUS1的表達，促進肺癌細胞系H1299的增殖，起到癌基因的作用。除此之外，miR-93在腫瘤的耐藥性機制中也發(fā)揮重要作用。另有研究表明,在卵巢癌和肝癌細胞中,miR-93通過調(diào)控PTEN/Akt通路影響腫瘤細胞的凋亡，繼而引發(fā)耐藥[16，17]。miR-93-3p是miR-93的一種亞型，能夠調(diào)節(jié)細胞的增殖、凋亡，參與耐藥機制的調(diào)控。Li等[18]研究發(fā)現(xiàn)，miR-93-3p參與鼻咽癌放療耐受機制的調(diào)控。本研究利用實時熒光定量方法檢測女性非吸煙肺腺癌患者癌組織中miR-93-3p的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其表達與臨床分期有關(guān)，在Ⅲ+Ⅳ期肺腺癌中高表達。近年來女性非吸煙肺腺癌患者趨于年輕化，本研究顯示，年輕女性中miR-93-3p高表達者預(yù)后不良，可能為其治療提供新的靶點。以上結(jié)果表明miR-93在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能起到促癌基因的作用。進一步分析發(fā)現(xiàn)，miR-93-3p在EGFR突變的肺腺癌組織中高表達，提示其與EGFR-TKI的耐藥機制有關(guān)。

綜上所述，在EGFR突變的女性非吸煙肺腺癌患者癌組織中miR-93-3p高表達；在年輕女性患者中，miR-93-3p高表達的患者生存較差，其可能成為女性非吸煙肺腺癌靶向治療的潛在靶點。

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Relationship between miR-93-3p expression and EGFR mutation in non-smoking female patients with lung adenocarcinoma

WANGYu1,ZHANGHuang,XUFangxiu,YUXiao,LINHongyan,QIANBiyun

(1TianjinMedicalUniversityCancerInstituteandHospital,Tianjin300060,China)

ObjectiveTo investigate the relationship between the mutation of epidermal growth factor receptor (EGFR) and the relative expression of miR-93-3p in lung adenocarcinoma tissues from non-smoking female patients.MethodsTotally 149 cases of non-smoking female patients with lung adenocarcinoma were selected. The expression levels of miR-93-3p in lung adenocarcinoma tissues from 112 cases of 149 patients were detected by real-time quantitative PCR. EGFR mutations were detected in 149 patients using DNA sequencing, and then we analyzed correlations of miR-93-3p expression with the clinicopathological features, EGFR mutation and prognosis.ResultsThe relative expression of miR-93-3p was associated with the clinical stage. The miR-93-3p EGFR mutations were found in 71 of 149 patients (47.65%). The relative expression of miR-93-3p in patients with EGFR mutations were higher than that of patients with wild type (P<0.01). There was no significant difference in prognosis between the patients with high and low expression of miR-93-3p, although the patients with high expression showed a poorer prognosis (P>0.05). Stratified analysis revealed that for patients younger than 60 years old, higher levels of miR-93-3 pexpression indicated worse prognosis (P<0.05). ConclusionThe expression of miR-93-3p is increased in patients with EGFR mutations, which suggests that miR-93-3p may be a new therapeutic target for the treatment of non-smoking female patients with lung adenocarcinoma, especially for young female ones.

non-small-cell lung cancer; female; tobacco, non-smoking; epidermal growth factor receptor; microRNA-93-3p

國家自然科學(xué)基金資助項目(81573231)；天津市自然科學(xué)基金資助項目(13JCYBJC23100)。

王玉(1991-)，女，碩士研究生在讀，主要研究方向為腫瘤分子流行病學(xué)。 E-mail: yuwang9113@163.com

簡介：錢碧云(1971-)，女，教授，主要研究方向為腫瘤分子與臨床流行病學(xué)。E-mail: qianbiyun@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.22.003

R734.2

A

1002-266X(2016)22-0008-04

2016-03-09)