高脂誘導非酒精性脂肪肝對CYP2A5表達的影響

崔一喆,王秋菊,李悅,周亞強,蘇景(.黑龍江八一農墾大學動物科技學院,黑龍江大慶6339;.黑龍江省動物疫病預防與控制中心,黑龍江哈爾濱50069)

高脂誘導非酒精性脂肪肝對CYP2A5表達的影響

崔一喆1,王秋菊1,李悅1,周亞強1,蘇景2
(1.黑龍江八一農墾大學動物科技學院,黑龍江大慶163319;2.黑龍江省動物疫病預防與控制中心,黑龍江哈爾濱150069)

為了研究高脂誘導脂肪肝對CYP2A5表達的影響,選取雄性C57BL/6J小鼠18只,隨機分成對照組(control)、高脂組(NAFLD)和陽性對照組(PYR),每組6只,分別飼喂基礎飼料和高脂飼料,陽性對照組飼喂基礎飼料在處死前一天給予吡唑誘導,連續8周后小鼠斷頸處死,取肝臟測定mRNA、CYP2A5的蛋白表達和酶活性.其結果陽性對照組CYP2A5的mRNA、蛋白表達和酶活性與對照組相比分別增加229%、80%、151%差異極顯著(P<0.01).高脂誘導組與對照組相比CYP2A5的mRNA、蛋白表達和酶活性分別增加69%、34%、43%(P<0.01).表明高脂誘導非酒精性脂肪肝可增加CYP2A5的mRNA、蛋白表達水平和酶活力.

非酒精性脂肪肝;CYP2A5;小鼠

隨著社會經濟的發展,非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的患病率逐年增長,目前已成為危害人類健康的三大肝病之一.同時,NAFLD在雞、狗、豬、牛、羊以及魚等動物也可發生,是各種動物的原發或者繼發性疾病.在各種動物中,雞、鴨的發病率較高,給禽類養殖業造成了嚴重的經濟損失.隨著患病的畜禽進入食品消費市場,又給食品安全帶來隱患,故而NAFLD不僅是臨床醫學、社會健康問題還是食品安全問題,研究NAFLD的發病機制、疾病的有效預防和治療均具有重要意義.細胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)是生物體內的Ⅰ相代謝酶,在藥物、致癌物、環境毒物等外源物和內源性物質的代謝中起重要的作用.CYP2A5在香豆素、尼古丁代謝及外源性藥物和致癌物如黃曲霉毒素、亞硝胺等的激活過程中發揮了重要的作用[1-2].由于CYP2A5在肝炎損傷以及不同致癌物的代謝過程中具有獨特的上調特性而被廣泛關注.許多研究已經表明,鼠肝細胞瘤以及瘤前肝細胞損傷時CYP2A5的表達均顯著升高,因此有學者提出將CYP2A5作為肝瘤形成的標志物[3-6].目前,關于非酒精性脂肪肝對(NAFLD)CYP2A5表達的影響,以及非酒精性脂肪肝對CYP2A5是否有協同作用等均未見報道.因此,本試驗旨在研究高脂誘導非酒精性脂肪肝對CYP2A5表達的影響.為預防肝臟相關性疾病和癌癥,指導臨床合理用藥提供依據.

1　材料與方法

1.1試驗動物的分組與處理雄性C57BL/6J小鼠18只,由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所提供,隨機分為陰性對照組、高脂組、陽性對照組,適應性喂養1周后,進入正式試驗.陰性對照組飼喂基礎飼料,高脂組飼喂高脂飼料,高脂飼料的配方由前期試驗確定(李曉沖等)[7],陽性對照組飼喂基礎飼料在處死前1 d給予吡唑誘導(腹腔注射,150 mg/kg體重),連續飼喂8周后斷頸處死,取出各試驗組小鼠肝臟,立即用生理鹽水沖洗,裝到樣品收集管中暫時用液氮冷凍-80℃保存.

1.2CYP2A5 mRNA含量的測定肝臟RNA提取嚴格按照Gibco TRIZol RNA提取試劑盒說明書操作.CYP2A5引物序列:上游5′-GGACAA-AGAGT TCCTGTCACTGCTTC-3′,下游5′-GTGTTCCACTTT CTTGGTTATGAAGTCC-3′;GADPH引物序列:上游5′-ACAGTCCATGCCATCACTGCC-3′,下游5′-GCCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′.引物由北京諾賽生物科技有限公司合成.RT-PCR擴增反應體系如下:下游引物各0.25 μL,滅菌注射用水7.5 μL,RT-PCR Mix 10 μL,cDNA 2 μL,反應總體系20 μL.反應條件:94℃預變性4 min;然后94℃變性30 s,57℃退火30 s,72℃延伸30 s,共30個循環;72℃終延伸5 min.擴增產物用實時定量PCR儀Bio-rad IQ5軟件進行分析.

1.3CYP2A5蛋白表達的測定采用牛血清白蛋白標準品(5 mg/mL BSA)根據說明書測定肝微粒體蛋白含量,以緩沖液稀釋,使代測蛋白樣品終濃度相同,等體積加入2XSDS上樣緩沖液,混合后沸水水浴10 min,冰上冷卻,取樣品10 μg進行Western-Blot. CYP2A5首抗用雞抗鼠多克隆抗體(University of Kuopio,Kuopio,Finland),1∶2 000稀釋,二抗用羊抗雞多克隆抗體,1∶2 000稀釋,β-actin作為內參.

1.4CYP2A5酶活性的測定取肝微粒體蛋白0.25 mg,加入50 mol/L的香豆素5 μL,用預溫(37℃)的50 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH值7.4)調整懸浮液體積為2.45 mL,裝入37℃預溫的熒光比色杯中,放入37℃振動水浴,用預溫的輔助液(每毫升含NADP 6.7 mg,葡萄糖-6-磷酸鹽31.0 mg,葡萄糖-6-磷酸脫氫酶24 μL)50 μL啟動反應,10 min后用10%三氯乙酸終止反應.用960型熒光分光光度計,以355 nm為激發波長,460 nm為發射波長(狹縫5 nm)測其熒光值,用0.1 mmol/L 7-羥基香豆素做內標,計算CYP2A5的比活性(nmol/mg),每個樣品重復測定3次.

1.5數據分析試驗數據采用SA9.0軟件中oneway ANOVA及體檢進行分析.結果采用Fig.P曲線擬合軟件繪制柱狀圖和曲線圖.

2　結果

2.1高脂誘導后CYP2A5 mRNA表達的變化高脂誘導后小鼠肝臟中CYP2A5基因mRNA表達結果如圖1所示.由圖1可見,與對照組相比,高脂組(NAFLD)和陽性對照組(PYR+)分別極顯著提高CYP2A5基因mRNA表達量69%(P<0.01)和229%(P<0.01),說明高脂(NAFLD)具有提高小鼠肝臟中CYP2A5mRNA表達的能力,但沒有達到陽性對照組的程度.

圖1　高脂對CYP2A5 mRNA表達的影響

2.2高脂誘導后CYP2A5蛋白表達的變化高脂誘導后小鼠肝臟中CYP2A5蛋白表達結果如圖2所示.由圖2可見,與對照組(Control)相比,高脂組(NAFLD)與陽性對照組(PYR+)小鼠肝臟中CYP2A5蛋白表達量,分別增加34%(P<0.01)和80%(P<0.01),均極顯著提高.

2.3高脂誘導后CYP2A5酶活性的變化高脂誘導后小鼠肝臟中CYP2A5酶活性變化結果如圖3所示.由圖3可見,與對照組(Control)相比,高脂組(NAFLD)與陽性對照組(PYR+)小鼠肝臟中CYP2A5酶活性分別增加43%(P<0.01)和151% (P<0.01),均極顯著差異.

3　討論

非酒精性脂肪肝(NAFLD)是一類除外酒精和其他明確的損肝因素所致的,以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變為主要特征的臨床病理綜合征[8].近年來,隨著肥胖和糖尿病的高發,NAFLD的發病率逐年升高,并被認為是隱原性肝硬化的主要原因之一,是僅次于病毒性肝炎的常見肝病[9]. NAFLD目前被認為是可以導致終末期肝病的一種疾病狀態,此外,非酒精性脂肪肝還與心血管疾病[10]、梗阻性呼吸暫停[11]具有密切的相關性.脂肪肝也是動物的原發性或繼發性疾病,給養殖業造成了嚴重的經濟損失.

圖2　高脂對CYP2A5蛋白表達的影響

圖3　高脂對CYP2A5酶活性的影響

肝損傷主要發生在疾病的早期,隨著病程的不斷的發展成為肝硬化或是肝癌,而CYP2A5的誘導作用發生在肝細胞損傷早期,CYP2A5表達作用增加明顯.本試驗采用高脂飼料喂養誘導非酒精性脂肪肝模型小鼠,結果顯示,CYP2A5 mRNA表達量增加,Western Blotting分析蛋白表達大量增加,與對照組相比明顯增加.CYP2A5活性明顯增高,三者變化相一致.這可能取決于機體內脂質內環境穩態或是肝臟脂肪酸組成的特殊變化,高脂飲食可增加線粒體和微粒體對脂肪酸的氧化而導致氧化應激,通過肝微粒體CYP450酶系表達及調控使活性氧增多(ROS),后者與多價不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應[12],生成過氧化脂質(LPO),LPO不僅使內源性ROS增脂肪酸發生脂質過氧化反應,LPO不僅使內源性ROS增加、毒性增強,且可抑制抗氧化系的保護作用,導致肝損害.CYP2A5是氧化應激在損傷肝部的特定區域催化外源物代謝的主要CYP酶[13].我們推測非酒精性脂肪肝微粒體CYP2A5表達增強與脂質過氧化和氧自由基的增加有關,體內脂質的不斷積累將損害肝細胞結構和功能,從而引起CYP2A5的改變.本研究說明,非酒精性脂肪肝小鼠肝臟CYP2A5表達的增強與非酒精性脂肪肝引起的肝臟損害密切相關,CYP2A5參與了非酒精性脂肪肝的發生發展.

目前,肝損傷尤其是非酒精性脂肪肝已成為全球共同關注的社會健康問題,食譜、環境或疾病等均會影響CYP2A5的表達,對該酶的調節將會直接影響煙癮、吸煙行為、外源物的致癌作用及藥物的療效.關于非酒精性脂肪肝損傷時CYP2A5的誘導與表達的機制尚不清楚.

4　結論

本試驗發現,高脂飼料誘導下,小鼠非酒精性脂肪肝從mRNA、蛋白質及酶活性水平3個方面均能顯著增強CYP2A5的表達.

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The expression of CYP2A5 in nonalcoholic fatty liver disease induced by high-fat diet

CUI Yi-zhe1,WANG Qiu-ju1,LI Yue1,ZHOU Ya-qiang1,SU Jing2
(1.College of Animal science and Veterinary,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing 163319,China; 2.Animal Diseases Prevention and Control center in Heilongjiang province,Harbin 150069,China)

This study was conducted to examine the effect of an experimental mouse model of NAFLD induced by high-fat feed on hepatic Cyp2A5 expression in vivo.Eighteen male C57BL/6J mice were randomly selected and divided into control group, high fat group and positive control group,and each group had 6 rats.Rats were fed with standard diet or high-fat diet.The positive control was fed with standard feed on the day before the rats were killed to pyrazole.At 8 weeks later,mice were executed,and CYP2A5 expression and enzyme activity were analyzed.The results showed that Pyrazole treatment resulted in statistically signifi?cant increases in levels of CYP2A5 mRNA,protein and catalytic activity by 229,80 and 151%,respectively(P<0.01).In high fattreated livers,CYP2A5 expression was significantly increased compared to that of controls at the mRNA(69%),protein(34%), and activity(43%)levels(P<0.01).These findings show that high fat diet induced non-alcoholic fatty liver disease may increase the expression of CYP2A5 mRNA,protein level and enzyme activity.

non-alcoholic fatty liver disease;cytochrome P450 2A5;mouse

WANG Qiu-ju

R 575.5

A

0529-6005(2016)02-0096-03

2014-10-20

黑龍江八一農墾大學校培育科研項目(X2R2014-05)

崔一喆(1979-),男,講師,博士,從事獸醫藥理學與毒理學研究,E-mail:cyz_79@yeah.net

王秋菊,E-mail:wqj_9@126.com