廣西首例牛肺炎支原體的分離和鑒定

陶立,潘艷,李軍,許力干,韋志鋒,秦若甫,蘭美益,楊威,周慶安,陳澤祥(1.廣西獸醫研究所,廣西南寧530001;2.廣西畜禽疫苗新技術重點實驗室,廣西南寧530001)

廣西首例牛肺炎支原體的分離和鑒定

陶立1,2,潘艷1,2,李軍1,2,許力干1,2,韋志鋒1,2,秦若甫1,2,蘭美益1,2,楊威1,2,周慶安1,2,陳澤祥1,2
(1.廣西獸醫研究所,廣西南寧530001;2.廣西畜禽疫苗新技術重點實驗室,廣西南寧530001)

近幾年來廣西從外省引進肉牛飼養的現象很普遍,因運輸應激因素誘發呼吸系統癥狀的疾病經常發生,臨床表現為發熱、流涕、咳嗽和呼吸困難,最終導致死亡.給養殖戶造成很大的經濟損失.為了弄清病因,2013年8月我們對桂林市某牛場出現的類似病例進行了病原調查.該場原有存欄牛336頭,2013年7月11日從北方某省引進肉犢牛93頭,到場后隔離觀察,第3天發現有牛出現喘氣,體溫升高.隨后多數牛也開始發病并出現嚴重的呼吸困難,臥地不起,拉稀或血樣糞便,部分牛最后因衰竭而死.曾用頭孢類抗生素治療無效,整個病程27頭牛發病,死亡7頭,發病率和病死率分別為29%(27/93)和25.9%(7/27).剖檢病死牛,病變局限在胸腔與肺部,肺尖葉、心葉和膈葉都表現出不同程度的紅色肉變,肺間質增寬,還可見大小不等的黃白色壞死灶,氣管、支氣管里有大量的乳白色泡沫.胸腔有少量積液,心包積水,液體呈清亮黃色.其他臟器未見肉眼可見病理變化.經對病原分離培養、形態學觀察、生化試驗和病原特異性基因PCR檢測,鑒定該病病原為牛支原體.

1　材料與方法

1.1試驗材料病死牛肝、腎、肺、淋巴結.

1.2試劑和儀器PPLO肉湯粉,購自杭州百思生物技術有限公司;瓊脂、TSA瓊脂、酵母,購自北京陸橋生物技術有限責任公司;馬血清,購自廣東蕊特生物科技有限公司;青霉素,購自山東魯抗醫藥股份有限公司;細菌微量生化鑒定管和藥敏試紙,購自杭州天和微生物試劑有限公司;微量DNA提取試劑盒,購自天根生化科技(北京)有限公司,DNA Marker2、PCR Taq Mix,購自廣東東盛生物科技有限公司;PCR儀,購自日本TaKaRa公司;凝膠成像系統,購自美國Alpha Inotech公司.

1.3方法

1.3.1病原分離、形態觀察、細菌L型實驗和生化性狀測定等均按石磊的方法[1]進行.

1.3.2病原PCR鑒定按李大偉的方法[2]進行病原的牛支原體特異性基因opp D/F的PCR鑒定,同時應用牛傳染性胸膜肺炎特異性引物對樣品進行鑒別診斷[1].將PCR擴增產物連接到pMD-18T載體中,對獲得的克隆進行鑒定后送上海生工生物工程技術服務有限公司測序和分析.

1.3.3藥敏試驗按秦若甫等[3]報道的方法進行.

1.3.4其他細菌的分離無菌取病牛肝、腎、肺、淋巴結分別接種TSA瓊脂培養基和兔血營養瓊脂培養基,37℃培養48 h觀察結果.

2　結果

2.1病原的分離培養和菌落形態初次培養時,將肺組織勻漿后的上清液接種PPLO培養液后3 d,培養基顏色開始變為棕黃色,繼續傳代培養時,培養基顏色變色時間縮短,在1～2 d,便可由紅色變為棕黃,培養液顏色均一,透亮無混濁現象.固體培養基上,2～4 d便可見針尖大小的菌落生長,在4X10倍視野下觀察所有平皿均有典型的"煎蛋樣"菌落出現,核心較厚,向下長入培養基中,周邊為一薄層的透明區(圖1).

2.2病原的染色形態觀察結果分離的病原革蘭染色不易著色,難以觀察;姬姆薩染色呈紫藍色,菌體呈現明顯的多形態,多數呈球形,也有少數長短不一的桿狀或蝌蚪狀的菌體散在分布(圖2).

2.3病原生化性狀和細菌L型測定病原細菌L型測定無其他細菌形態出現.生化試驗結果表明,只能發酵乳糖,不能水解精氨酸,對葡萄糖、木糖、覃糖、七葉苷、蔗糖、尿素和甘露醇均不能分解利用.

2.4PCR鑒定利用牛支原體特異性基因op?p D/F F1和F2引物可以從樣品中擴增出448 bp的片段,與預期相符,而應用牛傳染性胸膜肺炎特異性引物擴增樣品則為陰性(圖3).

圖1　病原菌落觀察(4X10)

圖2　病原姬姆薩染色觀察(10X100)

圖3　病原的PCR鑒定結果

2.5opp D/F基因序列測定與比較結果通過對病原的opp D/F基因的序列分析表明,病原(命名為Gxmboppdf)與國內首次分離的牛支原體HB0801及Hubei-1株同源性為99.3%(圖4).

2.6藥敏試驗結果經48 h培養后觀察,病原對氧氟沙星、環丙沙星、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、左氟沙星、恩諾沙星、林霉素、氯霉素、新霉素、強力霉素、諾氟少星、大觀霉素、四環素高敏;對丁胺卡那霉素中敏;對阿奇霉素、紅霉素低敏;對頭孢拉定、青霉素、頭孢曲松、利福平、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢唑啉、氨芐西林、羅紅霉素、多粘菌素、復方新諾明耐藥.

2.7其他細菌的分離無菌取病牛肝、腎、肺、淋巴結分別接種TSA瓊脂培養基和兔血營養瓊脂培養基,37℃培養48 h后未見有菌生長.

圖4　廣西牛支原體同源性比較及進化樹分析

3　討論

根據發病經過、臨床癥狀、病理變化、病原培養特性、生化試驗、PCR鑒定,確診該病為牛支原體(Mycoplasma bovis)引起的犢牛肺炎,即傳染性牛支原體肺炎.自美國人Hale(1961)首次從患乳腺炎的牛奶中分離到該病原,目前已證實牛支原體可引發牛肺炎、乳腺炎,此外,還可導致角膜結膜炎、耳炎、關節炎、生殖道炎癥、流產和不孕等多種疾病,已在世界范圍內存在.該病在歐洲最為嚴重,每年約有25%～33%的犢牛肺炎由牛支原體引起,經濟損失達1.44億～1.92億歐元[4-5].在美國每年由牛支原體引起的牛呼吸系統疾病和乳腺疾病所造成的經濟損失也高達1.40億美元,感染率高達70%[6].2008年,我國部分地區肉牛暴發了以壞死性肺炎為主要特征的犢牛肺炎疫情,辛九慶、石磊、冉智光等證實該疫情是由牛支原體引起的"傳染性牛支原體肺炎",疫情波及湖北、河南、山東、東北三省等多個省市自治區,幾乎涵蓋了中國養牛的主要產區,牛發病率高達50%～ 100%,病死率達10%～50%,給我國的養牛業造成巨大的經濟損失[1,7-8].廣西是飼養水牛最多的省(區),存欄437萬頭,奶牛存欄8.77萬頭,最近幾年肉牛產業也蓬勃興起,引種和流通增多,以肺炎癥狀為主的病例時有發生,不易治療,給養殖戶造成很大的經濟損失.在臨床診斷中,牛支原體引起的臨床癥狀和病理剖檢變化與牛傳染性胸膜肺炎類似,造成診斷上的困難,因此病原分離與鑒定成為最終確診的重要依據.本實驗室在收集到牛肺臟病料時進行了病原的分離和鑒定,結果分離到1株牛支原體.此前,廣西未見有牛支原體病的報道,本文首次報道了廣西從外地引進的肉牛有該病的存在,但本病在廣西的流行情況以及對廣西養牛業造成危害程度有待進一步調查.

目前尚無商品化的疫苗對牛支原體病進行預防,臨床上宜采取綜合性的防治措施.一是加強對牛群的引種檢疫,不從疫區引種,引種前應做好牛支原體病、結核、布魯菌病、泰勒蟲病等檢測,防止引進病牛或帶菌牛.牛群引回后應隔離檢疫,確保牛群健康并做必要的預防接種和驅蟲后方可混群;二是加強對牛群的飼養管理和消毒工作;三是對發病牛隔離治療,早發現,早診斷,早治療是有效控制本病的原則.在用藥上宜全群(和病牛接觸的牛群)用藥,療程要夠,藥量要足.藥敏試驗的結果表明,四環素類、喹諾酮類和泰樂菌素類對牛支原體敏感,但要注意經常變換藥物,以免耐藥性的產生而使治療效果不理想.

[1]石磊.牛支原體肺炎病原的鑒定、診斷和疫苗的初步研究[D].武漢:華中農業大學,2010.

[2]李大偉.牛支原體PCR診斷方法的建立及流行病學調查[D].呼和浩特:內蒙古農業大學,2011.

[3]秦若甫,李智紅,韋志鋒,等.二株綿羊肺炎支原體藥物敏感性試驗和臨床治療體會[J].廣西畜牧獸醫,2011,27 (3):165-166.

[4]Nicholas R A J,Ayling R D.Mycoplasma bovis:disease,diag?nosis,and control[J].Reasearch in Veterinary Science,2003, 74:105-112.

[5]Hale H H,Helmboldt C F,Plastridge W N,et al.Bovine mastitis caused by Mycoplasma species[J].Comell vet,1962,52:582-591.

[6]Caswell J L,Archambault M.Mycoplasma bovis pneumonia in cattle[J].Anim Health Res Rev,2008,8(2):161-186.

[7]辛九慶,李媛,郭丹,等.國內首次從患肺炎的犢牛肺臟中分離到牛支原體[J].中國預防獸醫學報,2008,30(9):661-664.

[8]冉智光,謝建華,駱璐,等.我國部分地區牛支原體肺炎和關節炎的病原體診斷[J].中國預防獸醫學報,2010,32(1): 40-43.

S852.65+3文獻標志碼:B

0529-6005(2016)02-0046-02

2014-02-31

廣西畜禽疫苗新技術重點實驗室專項(14-045-31-A-6);廣西科研基本業務費桂科專項(15-3)

陶立(1964-),男,高級獸醫師,本科,從事動物疫病的防制和研究工作,E-mail:gxlitao1223@163.com

陳澤祥,E-mail:xjszexiang@163.com