異形同刺線蟲形態學鑒定及基于核糖體ITS序列分子進化分析研究

高俊峰,王麗坤,李洪斌,崔宇超,侯美如

(黑龍江省獸醫科學研究所寄生蟲研究室,黑龍江齊齊哈爾161006)

異形同刺線蟲形態學鑒定及基于核糖體ITS序列分子進化分析研究

高俊峰,王麗坤,李洪斌,崔宇超,侯美如

(黑龍江省獸醫科學研究所寄生蟲研究室,黑龍江齊齊哈爾161006)

對采自黑龍江省某鵝場萊茵鵝盲腸內的線蟲進行形態學鑒定,然后采取PCR方法擴增蟲體核糖體ITS序列,進行序列分析并以ITS序列為標記基因構建系統發生樹,分析該線蟲與其他蟲體的進化關系.結果表明,所分離的蟲體為異形同刺線蟲(Ganguleterakis dispar),該線蟲ITS序列全長為957 bp,其中ITS-1,5.8S和ITS-2大小分別為424 bp, 157 bp和376 bp.應用BI,MP,NJ 3種方法構建系統發生樹結果相同,在尖尾目線蟲的分支中,本研究的5條異形同刺線蟲聚集在一起,與同科的雞異刺線蟲親緣關系較海綿異刺線蟲和Heterakis dahomensis接近.該結果為禽類異形同刺線蟲病的分子鑒別診斷方法提供了參考.

異形同刺線蟲;ITS序列;分子進化分析

異形同刺線蟲隸屬于有尾感器亞綱(Secern?entia),尖尾目(Oxyurida),異刺科(Heterakidae),同刺屬(Ganguleterakis),是一種對禽類危害較大的寄生線蟲.該蟲寄生于鴨、鵝和野生禽類的盲腸內,造成盲腸組織機械性損傷、盲腸腫大、腸壁增厚形成結節,引起盲腸炎和下痢.同時蟲體分泌的毒素和代謝產物使宿主中毒,嚴重者可造成死亡.

核糖體內轉錄間隔區(ITS,internal transcribed spacer region)序列被證實是良好的遺傳標記[1],廣泛的應用于寄生蟲領域.目前,關于異形同刺線蟲的研究和報道還較少,主要集中在流行病學調查方面,雖然黑龍江省曾有過鵝寄生異形同刺線蟲的報道,但并未對形態學進行詳細的描述,另外,異形同刺線蟲分子領域的研究還未見報道.鑒于此,本試驗以萊茵鵝體內分離的異形同刺線蟲為研究對象,描述其主要形態學特征,并對其ITS序列進行擴增,探討其分子進化關系,為異形同刺線蟲的分子鑒定及鑒別診斷方法的構建提供參考依據.

1　材料與方法

1.1蟲體2014年6月,剖檢黑龍江省齊齊哈爾市周邊某鵝場病死成年萊茵鵝,于盲腸內收集到大量新鮮蟲體,經生理鹽水沖洗后,保存于70%乙醇中固定備用.

1.2主要試劑La Taq DNA聚合酶,dNTPs,DL-2 000 DNA Marker,pMD18-T載體,限制性內切酶EcoR I,限制性內切酶Hind III,均購自寶生物工程(大連)有限公司;Tissue DNA Kit,購自OMEGA bio-tek公司;AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒、質粒小量制備試劑盒,購自愛思進生物技術(杭州)有限公司.

1.3形態學鑒定將乙醇中固定的蟲體取出,置于載玻片上,加1滴甘油酒精使蟲體透明后,于顯微鏡下觀察,記錄數據.

1.4總DNA的提取選取5條成蟲樣品,分別置于無菌離心管中,利用DNA提取試劑盒提取蟲體總DNA,提取的DNA樣品-20℃保存備用.

1.5ITS序列的擴增及序列分析

采取GenBank登錄的通用引物NC2/NC5

上游引物NC5:5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′

下游引物NC2:5′-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3′.

PCR反映體系為25 μL;反應條件為:92℃2 min;92℃30 s、50℃30 s、72℃1 min,共35個循環,最后72℃延伸5 min.PCR擴增產物于0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行檢驗,形成單一清晰條帶.

按照膠回收試劑盒說明書將ITS序列純化回收后,連接于pMD18-T載體中,轉化到JM109大腸桿菌感受態細胞內,篩選陽性重組菌,提取質粒DNA,經過PCR鑒定和EcoR I,Hind III雙酶切鑒定后,陽性質粒送往上海生工生物工程技術服務有限公司進行雙向測序.利用生物學軟件DNAStar,將擴增的序列與相關線蟲ITS序列進行比對分析,確定ITS各段的大小.

1.6系統發生樹的構建以無尾感器亞綱的旋毛蟲(Trichinella spiralis)為外群,將本研究所獲得的異形同刺線蟲與尖尾目已知序列的相關線蟲的核糖體序列進行比對分析(見表1).將上述線蟲核糖體ITS序列人工進行整合,將ITS-1和ITS-2基因序列串聯進行比對,提交引導樹.使用MrBayes進行貝葉斯推演構建進化樹.最大簡約法和最大似然法利用PAUP*4.0b 10軟件包,在默認設置下進行分析.繪制系統發生樹,探討異形同刺線蟲的系統發生位置.

表1　本研究構建尖尾目線蟲系統發生樹選擇的線蟲及相關信息

2　結果

2.1蟲體的形態學鑒定此次從鵝體內分離的蟲體呈乳白色,體表有橫紋,體前部有側翼膜,頭端鈍,具有3個唇片.口腔短,食道呈圓柱形,后端為發達的食道球和食道瓣,排泄孔位于食道中部.雄蟲長13.2～14.7 mm,尾末端尖細,具有2根等長、形態相同的交合刺,無引帶.尾部有發達的尾翼膜,使蟲體末端向腹面彎曲,有13對肛乳突及1個圓形的泄殖孔前吸盤;雌蟲長15.2～ 18.3 mm,尾細長,末端彎向背面,生殖孔位于體中部稍后方,見中插彩版圖1.以上觀察結果與參考文獻[2]描述的一致,故鑒定為異形同刺線蟲. 2.2 ITS序列的擴增與序列分析經通用引物擴增出的異形同刺線蟲ITS序列,產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢驗,擴增的條帶均出現在約1 000 bp位置,與預期目的片段一致(圖2),且無非特異性條帶.基因片段經測序后人工校正,得到完整的ITS序列,全長為957 bp,其中ITS-1, 5.8S和ITS-2大小分別為424 bp,157 bp和376 bp.將獲得的ITS基因序列錄入GenBank,獲得基因登錄號為KM212953.

圖2　異形同刺線蟲核糖體ITS PCR擴增結果M:DL-2 000標準分子量;1～5:異形同刺線蟲樣品;6:陰性對照

2.3分子進化分析構建尖尾目線蟲系統發生樹,以旋毛蟲作為外群,參與構群的線蟲除了本研究的異刺科的異形同刺線蟲外,還包括尖尾科的無刺屬、住腸屬、釘尾屬、管狀屬,異刺科的異刺屬和副盾皮屬.結果顯示,采用Bayes,MP和NJ 3種方法構建進化樹結果基本一致.在尖尾目進化樹中,本研究分離的五個異形同刺線蟲樣品處于聚集在一起,與雞異刺線蟲親源性最近,處于同一分支,海綿異刺線蟲和H.dahomensis親緣性最近,處于同一分支.有鉤副盾皮線蟲與其他異刺科線蟲具有較高的親源性,較尖尾科線蟲親源關系近(圖3).

圖3　MP,BI和NJ 3種方法構建的異形同刺線蟲系統發生樹

3　討論

異形同刺線蟲病呈世界性分布,多地曾報道[3-5],在黑龍江省,除1981年區域調查時在鴨鵝和王春仁(2004)報道過鴻雁感染過外[6],再未見禽類發生該病的報道,作者分析不是該蟲感染少,而是一直被誤認為是雞異刺線蟲.盡管雞異刺線蟲和異形同刺線蟲成蟲形態學非常相似,但是可以通過雄蟲交合刺的形狀來鑒別.異刺線蟲雄蟲右側交合刺較左側長,而異形同刺線蟲具有兩根等長的交合刺.本試驗分離的線蟲根據寄生部位、蟲體大小及形態特點與之前文獻描述[2]的異形同刺線蟲一致,故鑒定為異形同刺線蟲.

核糖體DNA(rDNA)序列因其功能上的高度保守性和進化的時鐘性,已被廣泛地應用于物種分類和遺傳進化關系的研究,尤其是物種的種間分類研究[7].唐穎[8]等對東北地區不同地理位置采集的華支睪吸蟲ITS1序列多態性研究,結果證實ITS1序列可以區分種間遺傳關系.嚴若峰等[9]對捻轉血矛線蟲不同藥物耐藥性蟲株,不同地理位置和不同宿主來源的蟲株ITS序列進行了研究,結果表明,捻轉血矛線蟲ITS序列在種內相對保守,不同蟲株間變異較小.閆文朝等[10]對兔斯氏艾美耳球蟲ITS序列進行研究,發現斯氏艾美耳球蟲蟲株種內變異率較高,且與雞球蟲和嚙齒類動物球蟲同源性較低.大量研究表明,ITS序列是寄生蟲蟲種鑒定和分子診斷方法中具有重要應用價值的基因區段.因此,本試驗是首次對異形同刺線蟲核糖體ITS序列進行研究報道,通過對ITS序列的比對分析,探討異形同刺線蟲的種間差異情況和在尖尾目中的系統發生關系.

尖尾目線蟲中,P.ambiguus的ITS1(292)和ITS2(306)長度均為目前已知最小,而A.tetraptera的ITS1(662)和ITS2(598)長度均為目前已知最大(見表1).本研究擴增的5條異形同刺線蟲樣品ITS序列,經過生物學軟件分析,ITS序列長度為957 bp,其中ITS-1和ITS-2大小分別為424 bp和376 bp,均在尖尾目線蟲長度范圍內,與先前的研究相一致.本試驗5個樣品的ITS序列幾乎完全一致,僅在樣品1中ITS-2的第202位點A突變成C;在樣品2中ITS-2的第297位點T突變成C,其余序列均一致.

通過對本試驗擴增的異形同刺線蟲ITS序列進行分析,與尖尾目線蟲同源性分析,與異刺科線蟲同源性要遠遠高于尖尾科線蟲,在異刺科內的種間差異為24.2%～52.7%.ITS1和ITS2序列G+C含量分別為44.0%和42.8%,除較P.uninata(49.0%和44.6%)、P.ambiguus(52.4%和57.5%)和S.muris (47.0%和46.8%)的ITS1和ITS2序列G+C含量低,比其他尖尾目線蟲ITS1和ITS2序列G+C含量高.

利用Bayes,MP和NJ構建的尖尾目線蟲系統發生樹結果表明,本試驗中的異形同刺線蟲樣品與雞異刺線蟲親緣性最近,處于同一分支,海綿異刺線蟲和H.dahomensis親緣性最近,處于同一分支.有鉤副盾皮線蟲與其他異刺科線蟲具有較高的親源性,較尖尾科線蟲親源關系近,該結果與傳統的形態學分類結果相一致,本試驗結果表明,ITS片段可作為遺傳標記用以鑒定異刺科線蟲種間遺傳關系,是良好的遺傳標記,本試驗的結果對異形同刺線蟲進一步的分類、鑒定、遺傳變異研究、防治等具有重要意義.

[1]牛慶麗,羅建勛,殷宏.轉錄間隔區(ITS)在寄生蟲分子生物學分類中的應用及其進展[J].中國獸醫寄生蟲病,2008,16 (4):41-47.

[2]趙輝元.家畜寄生蟲與防制學[M].長春:吉林科學技術出版社,1996.

[3]Zhao C,Onuma M,Asakawa M,et al.Preliminary studies on de? veloping a nested PCR assay for molecular diagnosis and identifi?cation of nematode(Heterakis isolonche)and trematode(Glaphy?rostomum sp)in Okinawa rail(Gallirallus okinawae)[J].Vet Para?sitol,2009,163(1-2):156-160.

[4]Callinan R B.Nodular typhlitis in pheasants caused by Heterakis isolonche[J].Aust Vet J,1987,64(2):58-59.

[5]Frank C.First detection of Heterakis isolonche in Burgenland[J]. Angew Parasitol,1977,18(3):162-163.

[6]王春仁,鄒希明,翟寶庫,等.黑龍江省鴻雁體內檢出異形同刺線蟲[J].黑龍江畜牧獸醫,2004(01):38-39.

[7]林睿,黎學銘.吸蟲種株基因差異的研究進展[J].廣西預防醫學,2002,8(5):310-313.

[8]唐穎,路義鑫,韓彩霞,等.東北地區華支睪吸蟲ITS1基因序列分析[J].中國預防獸醫學報,2011,33(5):405-407.

[9]嚴若峰,宋小凱,徐立新,等.基于ITS序列的捻轉血矛線蟲系統進化分析[J].畜牧獸醫學報,2012,43(7):1117-1122.

[10]閆文朝,韓利方,張龍現,等.斯氏艾美耳球蟲ITS1-5.8S rRNA-ITS2序列的克隆及PCR檢測方法的建立[J].畜牧獸醫學報,2012,43(6):1003-1008.

M orphological identification and molecular phylogenetic analyses based on ITS sequences of Ganguleterakis dispar

GAO Jun-feng,WANG Li-kun,LI Hong-bin,CUI Yu-chao,HOU Mei-ru
(Department of Parasitology,Heilongjiang Institute of Veterinary Science,Qiqihar 161006,China)

Morphological identification methods were used to identify the species of the nematode,which were isolated from goose(Rhine geese)intestinal collected from Heilongjiang.Then the ITS sequence was amplified by polymerase chain reaction (PCR)and compared with other nematodes available in GenBankTMby biology software,and phylogenetic relationships betweep them were reconstructed.The result showed that the length of ITS sequence was 957 bp and ITS-1,5.8S and ITS-2 sequences of G.dispar were 424 bp,157 bp and 376 bp in length,respectively.Topologies of all trees inferred by three different methods(BI, MP,and NJ)with different building strategies and/or different distance models were identical.Five samples of G.dispar in the study were clustered together.The result provides a reference for molecular identification diagnostic method of this disease.

Ganguleterakis dispar;ITS sequences;Phylogenetic analyses

HOU Mei-ru

S852.73+1

A

0529-6005(2016)02-0018-03

2014-11-18

黑龍江省青年科學基金項目(QC2014C033)

高俊峰(1985-),男,碩士,主要從事分子寄生蟲學與動物寄生蟲病防治的研究,E-mail:13766785033@163.com

侯美如,E-mail:houmeiru168@126.com