血清錳含量測定方法的改進

米俊憲,張磊,皇甫和平,葉曉敏(河南牧業經濟學院動物醫學系,河南鄭州450046)

血清錳含量測定方法的改進

米俊憲,張磊,皇甫和平,葉曉敏
(河南牧業經濟學院動物醫學系,河南鄭州450046)

為了達到簡化操作流程、縮短檢測時間的目的,本試驗從樣品的前處理、甲醛肟試劑添加量、反應溫度、反應時間等方面對國標測定水中錳含量的方法作出改進.試驗結果表明,采用干濕結合法對血清進行前處理可縮短處理時間,減少鹽酸揮發給人體帶來的傷害;甲醛肟試劑最佳添加量為3 mL,最佳反應時間為30 min;最低檢測限達5 μg/L.改進后的檢測方法操作相對簡單、檢測時間短、檢測結果準確,值得推廣應用.

血清錳;測定;分光光度法

錳是動物所必需的微量元素,大量研究表明,錳在動物機體中有重要營養作用,它是精氨酸激酶、丙酮酸梭化酶的重要組成部分,也是部分激酶、轉移酶、水解酶等的激活劑,具有促進生長、增強免疫力和提高動物繁殖性能等作用[1],對動物產生的副作用也較小[2].因此,有必要對動物體內錳的含量進行測定研究,并最終在生產中更準確、更科學地評價動物的錳營養狀況并滿足其錳營養需要,從而最終達到促進動物健康、高效生產的目的.而現有的測定方法或者需要繁雜的樣品預處理[3],或者干擾因素多,或者靈敏度低,或者設備儀器昂貴[4]故而設計了本試驗.本試驗針對國標測定水中錳含量的方法(GBT 8538-2008-4.16)作出改進,以達到簡化操作流程、縮短檢測時間的目的.并用此方法來檢測血清中錳含量,與原子吸收光譜法測定結果比較,判定其準確性[5].

1　材料與方法

1.1試劑硫酸亞鐵銨溶液:稱取70 mg硫酸亞鐵銨[(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O],加入10 mL硫酸溶液(1+ 9),用去離子水稀釋至1 000 m L;氫氧化鈉溶液(160 g/L):稱取160 g氫氧化鈉(NaOH),溶于去離子水,并稀釋至1 000 mL;甲醛肟試劑:稱取10 g鹽酸羥胺(NH2OH.HCL)溶于50 mL去離子水中,加入5 mL甲醛溶液(p20=1.08 g/ml),用去離子水水稀釋至100 mL,將試劑保存在陰涼處,至少可保存1個月;EDTA-Na2溶液(372 g/L):稱取37.2 g EDTANa2,加入約50 mL氫氧化鈉溶液攪拌至完全溶解,用純水稀釋至100 mL;氨水溶液(35+100):量取70 mL氨水(p20=0.88 g/mL),用去離子水稀釋至200 mL;鹽酸羥胺溶液:稱取41.7 g鹽酸羥胺(NH2OH.HCL),溶于去離子水并稀釋至200 mL;氨性鹽酸羥胺溶液:將氨水溶液和鹽酸羥胺溶液等體積混合即成;錳標準貯備溶液(1 mg/mL):稱取1.2912 g氧化錳(MnO,優級純),加硝酸溶液(1+1)溶解后,用純水定容至1 000 mL,搖勻備用;錳標準使用溶液(10 μg/mL):吸取5.0 mL錳標準貯備溶液,用純水定容至500 mL.

1.2試驗器材722N型分光光度計(由蘇州市萊頓科學儀器有限公司生產);FA2004型電子天平(上海精密儀器廠生產);SX2-4-10型馬福爐(由天津天有利科技有限公司生產);水浴鍋.

1.3不同甲醛肟試劑添加量對測定結果的影響

取150 mL錐形瓶6個,各加入50.0 mL錳標準使用溶液和1.0 mL硫酸亞鐵胺溶液,再分別加入0.5 m L、1.0 m L、1.5 m L、2.0 m L、2.5 m L、3.0 m L甲醛肟試劑,混勻.然后各加入0.5 mL EDTA-Na2溶液,并立即加入1.5 mL氫氧化鈉溶液,混勻后靜置10 min.再加入3 mL氨性鹽酸羥胺溶液,至少放置1 h,于450 nm波長下,用1 cm比色皿以純水為參比,測定各溶液的吸光度[3].

1.4不同反應溫度對測定結果的影響取150 m L錐形瓶8個,各加入50.0 m L錳標準使用溶液和1.0 mL硫酸亞鐵胺溶液,再加入1.0 mL甲醛肟試劑,混勻.然后各加入0.5 mL EDTA-Na2溶液,并立即加入1.5 mL氫氧化鈉溶液,混勻后靜置10 min.再加入3 mL氨性鹽酸羥胺溶液,將溶液混勻后分別置于室溫、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴鍋中,1 h后取出冷卻,于450 nm波長下,用1 cm比色皿以純水為參比,測定各溶液的吸光度.

1.5不同反應時間對測定結果的影響操作方法同1.4,室溫下每隔10 min于450 nm波長下,用1 cm比色皿以純水為參比,測定各溶液的吸光度.

1.6不同前處理對樣品檢測結果的影響將待測樣品(健康成年犬血清)采用下列不同處理方法,測定其錳含量,并作比較[6].

不作處理:將采集靜脈血分離得到的血清直接進行測定.

干消化法:取樣品于坩堝中,加1 mL硝酸,待黃煙消逝后,移入馬福爐200℃炭化2 h,然后將溫度升至500℃,繼續炭化6 h,冷卻,取出加0.12 mL硝酸溶樣,轉入10 mL比色管,定容.

濕消化法:取樣品于50 mL比色管,加濃硝酸2 m L,少頃冒黃煙,待試樣近溶解,置于馬福爐上消解,消化液呈淺黃色,加雙氧水3～5滴,反復幾次,直至樣品呈無色透明.轉移至10 mL比色管,定容.

干濕結合法:取樣品1 mL于錐型瓶中,加純水至50 mL水樣,再加0.5 mL硝酸,0.25 mL過硫酸鉀,放入玻璃珠數粒,在電爐上煮沸30 min,取下稍冷,用快速定性濾紙過濾,用硝酸溶液洗滌濾紙數次.濾液中加入0.5 mL亞硫酸鈉,用純水定容至50 m L,作為測試溶液[7].

1.7測定范圍的確定取150 mL錐形瓶12個,分別加入錳標準使用溶液0、0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9 mL,各加去離子水至50 mL.再加入1.0 mL硫酸亞鐵胺溶液和1.0 mL甲醛肟試劑,混勻.然后各加入0.5 mL EDTA-Na2溶液,并立即加入1.5 mL氫氧化鈉溶液,混勻后靜置10 min.再加入3 m L氨性鹽酸羥胺溶液,將溶液混勻,30 min后于450 nm波長下,用1 cm比色皿以純水為參比,測定各溶液的吸光度.繪制吸光度曲線,判斷本檢測方法的測定范圍[8].

1.8準確性分析取含錳10 mg/L的標準溶液和健康成年犬血清各1 mL,加去離子水至50 mL,再按照1.5的方法測定其吸光度,計算出錳含量,并與用原子吸收法測定結果比較,判斷其準確性[9]. 1.9干擾試驗在含錳10 mg/L的標準溶液中分別加入1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L的銅、鋅、鐵、鈉、鉀、鉛、鈣、鎂、鈷,用以上試驗方法確定最佳反應條件,測定各溶液的吸光度值,判斷以上物質對測定結果的影響[10].

2　結果與分析

2.1不同甲醛肟試劑添加量對測定結果的影響

不同甲醛肟試劑添加量測得溶液吸光度值如表1和圖1所示.從圖1可以看出,在反應溶液中添加1 mL甲醛肟試劑時測得的吸光度值最高,即此時顯色效果最好.

2.2不同反應溫度對測定結果的影響見表1.

從表1可以看出,隨著反應溫度的升高,測定結果變化值不大,說明溫度對顯色反應的影響較小.而隨著溫度的升高,溶液的揮發量也逐步增大,溶液中錳的濃度也會隨之發生微量變化,為保證測定結果的準確性,反應宜室溫下進行.

2.3不同反應時間對測定結果的影響從圖2可以看出,反應時間達到30 min以上,測定結果逐步穩定,說明此時顯色穩定.

圖1　不同甲醛肟試劑添加量測得溶液吸光度值

表1　不同反應溫度對測定結果的影響

圖2　不同反應時間測得溶液吸光度值

2.4不同前處理對樣品檢測結果的影響對不同的前處理樣品進行5次平行檢測,其吸光度值如表2.

表2　不同前處理對樣品檢測結果的影響

從表2可以看出,不作處理的樣品檢測結果比干消化法和濕消化法處理的略低,但它們之間差異不顯著(t檢驗).采用干濕結合法處理的樣品檢測結果相差也不大,而這種方法處理時間短,且處理過程中強酸的揮發量大大降低,減少了對人體的傷害.

2.5測定范圍不同濃度錳溶液測得吸光度值如圖3所示.

從圖3可以看出,在測定試驗范圍內,錳濃度>0.10 μg/L時,吸光度曲線呈近似直線,用Microsoft Office Excel計算所得線性方程為y=0.0343x+0.0543, R2=0.9991,說明方程與曲線擬合程度較高.根據方程可推導出公式x=29.1545y-1.5831,即可根據溶液測得的吸光度值y,計算出溶液的含錳量x.若樣品量為1 mL,則最低檢測限為5 μg/L.

2.6測定方法的準確性測定含錳100 μg/L的標準溶液和健康成年雞血清吸光度值,并計算所得錳濃度為100.1218±0.2171 μg/L和100.2132 μg/ L.而用原子吸收光譜法測定其錳含量分別為100.0265 μg/L和100.1520 μg/L,與本試驗方法測定結果差異不顯著(t檢驗),說明本試驗方法準確性好,可靠程度較高.

2.7測定方法的抗干擾性1、5、10、50、100 mg/L的銅、鋅、鈷測得:銅超過5 mg/L,鎳超過2 mg/L,鋅超過錳濃度50 mg/L時對本法有干擾.在鹽酸羥胺和乙二胺四乙酸二鈉存在下,25 mL溶液中分別含有5 mg Cu2+、Fe3+、Mg3+、Al3+、Zn2+、Ca2+則對本試驗無明顯干擾.

圖3　不同濃度錳標準使用液吸光度值

3　討論

本方法標準曲線線性關系好,判定系數R2= 0.9991,顯色幾乎不受溫度影響.

由結果可看出,甲醛肟的不同添加量對測定的吸光度值有不同程度的影響,其添加量為1 mL時所測得的吸光度值最高、顯色效果最好.波長選擇在450 nm所測的吸光度值最準確最能保證相對較高的靈敏度.溫度雖然影響不大但過低過高都不利于反應的進行,最適宜的是在室溫下進行.反應時間影響著顯色的穩定性以及測定結果的穩定性,由于錳(Ⅱ)與甲醛肟形成的配合物是無色的,但是能立即被空氣中氧氧化為褐紅色的錳(Ⅳ)一甲醛肟,因此,操作時需靜置10 min,以使顯色完全.由本次試驗測得放置時間在30 min后測得的結果穩定而且準確度也高,但超過l2 h后其穩定性同樣會降低.

在本次試驗中重點對樣品前處理的方法進行了比較分析,由試驗結果可以看出,不同的前處理方法所測定的結果相差不大,它們都適用于血清錳的檢測,但它們在時間上,操作的簡便程度上以及對人體健康方面的影響卻有著差別.干灰化法所需時間長,耗能大,需特定設備.濕式分解法在處理樣品過程中不易損失金屬元素,所需時間也短,有較高的準確度和重現性,方法操作簡單,易于掌握,但費試劑,還可能帶來試劑、容器和環境的污染以及某些元素揮發損失;干濕結合法,沒有污染、吸附等問題,操作簡單,分析偏差小,準確度高,是一種理想的方法.數據表明,本方法不僅可以減少化學試劑的消耗量,縮短消化時間,而且處理效果可以達到濕消化法和國標干消化法的水平.

在測定范圍內根據吸光度值繪制標準曲線,可在標準曲線圖中查出溶液中的含錳量.該方法測得的數據準確性好,可靠程度高,可予以推廣.

采用干濕結合法所測的結果受銅、鋅、鐵、鈉、鉀、鉛、鈣、鎂、鈷等離子的干擾不明顯且干擾離子容易消除.當含鐵量較高時,可加入EDTA掩蔽.準確度高,重現性較好.由此可以看出,本法不僅具有較高的靈敏度,而且具有較好的選擇性,可直接用于血清中痕量錳的測定.

4　結論

本試驗對國標測定水中錳含量的方法作了改進,試驗結果表明,采用干濕結合法對血清進行前處理可縮短處理時間,減少由于強酸揮發給人體帶來的傷害;甲醛肟試劑最佳添加量為3 mL,最佳反應時間為30 min;最低檢測限達5 μg/L.改進后的檢測方法操作相對簡單、檢測時間短、檢測結果準確,值得推廣應用.

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S852.5+3

A

0529-6005(2016)02-0040-04

2014-06-25

米俊憲(1982-),男,助教,碩士,從事臨床獸醫學工作,E-mail:mijx02@163.com