間接血凝檢測雞柔嫩艾美耳球蟲血清抗體方法的建立

王黎霞,劉新月,宋麗聰,趙晨璐,張建軍,安健(.北京農業職業學院畜牧獸醫系,北京房山044;.北京農學院動物科學技術學院,北京昌平006)

間接血凝檢測雞柔嫩艾美耳球蟲血清抗體方法的建立

王黎霞1,劉新月2,宋麗聰2,趙晨璐2,張建軍2,安健2
(1.北京農業職業學院畜牧獸醫系,北京房山102442;2.北京農學院動物科學技術學院,北京昌平102206)

為了快速檢測免疫球蟲后宿主血清中特異性抗體的水平,以DE-52層析純化子孢子、裂殖子,超聲裂解獲取可溶性蛋白;原核表達EtMIC4-N蛋白,致敏戊二醛醛化后的紅細胞,以人工免疫柔嫩艾美耳球蟲后分離的血清為陽性血清,以SPF雞分離的血清為陰性血清,建立柔嫩艾美耳球蟲間接血凝試驗.結果顯示,稀釋度為1∶2萬鞣酸處理戊二醛醛化后的紅細胞,使用100 μg/m L可溶性裂殖子、子孢子蛋白或12.5 μg/mL表達的重組蛋白EtMIC4-N均可以與陽性血清發生反應(可達1∶1 024),與雞的陰性血清及大腸桿菌病的陽性血清無反應,與堆型艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲陽性血清有微弱反應(不超過1∶8).試驗證明,該方法具有簡單、方便、快捷、靈敏等優點.

雞柔嫩艾美耳球蟲;間接血凝試驗

雞球蟲病是由原生動物門寄生蟲艾美耳屬感染雞所引起的一種呈全球性分布的痢疾性疾病,其感染后可以造成雞只的生長發育受阻、生產性能下降甚至死亡等危害.伴隨著集約化養雞業的發展,本病的危害也必將日趨嚴重,因此,如何防治本病將成為目前養雞業的難題之一.

目前,我國養禽業在很大程度上仍依賴于靠使用抗球蟲藥物或活疫苗來防治球蟲病,但由于抗球蟲藥物多存在耐藥性、環境污染和政府法律法規限制等問題有待解決,而使得相關球蟲活疫苗的研究越來越受到人們的關注,但免疫后的監測問題仍是當前發展疫苗所急需解決的問題之一.尋找一種快速檢測球蟲血清抗體水平的方法不僅能夠了解疫苗的免疫效果同時,還可以及時監測養殖場中宿主對球蟲免疫保護力的變化,并可以根據這些變化來進行相應免疫策略的改變,進而便可以更好地防治球蟲病.目前用于檢測雞球蟲病血清抗體的方法很多,如凝集試驗、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等[1].本試驗我們采用間接血凝的方法檢測雞柔嫩艾美耳球蟲免疫后的血清抗體水平,旨在提供一種方便快捷監測雞球蟲病血清抗體的方法,為更好的采用球蟲活苗防治雞球蟲病打下基礎.

1　材料與方法

1.1試驗材料25%戊二醛,購自西隴化工股份有限公司;鞣酸,購自天津市科密歐化學試劑有限公司;綿羊紅細胞,采自北京農業職業學院;疊氮鈉、硫柳汞及PBS試劑,購自北京廣泰偉業有限公司;蛋白表達相關試劑,購自北京康為試劑有限公司.

柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenlla)BJ4孢子化卵囊由北京農學院球蟲實驗室保存.

1日齡小公雞,購自大興某雞場,確保無球蟲感染.

1.2抗原液的制備(1)柔嫩艾美耳球蟲微線4 (EtMIC4-N)重組蛋白的表達:EtMIC4-N重組蛋白的原核表達用北京農學院球蟲實驗室保存的蟲株進行誘導表達,經純化后獲得,并使用紫外分光光度計測定其含量;(2)子孢子、裂殖子抗原液的制備:用DE-52纖維素柱對球蟲子孢子、裂殖子進行純化,經3 500 r/min離心沉淀后加適量的pH值7.6磷酸鹽緩沖液重懸.然后反復凍融并冰浴超聲破碎,10 000 r/min離心,吸取上清液,其余沉淀反復操作如上,最后合并以上收集的上清液,使用紫外分光光度計測定其蛋白含量;(3)血清制備:7日齡公雛經口接種柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊1X104個,接種2次,間隔2周.最后1次接種1周后采心血,分離血清,作為陽性血清.用瓊脂擴散試驗檢測雞抗柔嫩艾美耳球蟲抗體的效價,-20℃保存備用.陰性血清、堆型艾美耳球蟲陽性血清、巨型艾美耳球蟲陽性血清及雞大腸桿菌陽性血清按常規方法制備.

1.3綿陽紅細胞的醛化致敏靜脈無菌采綿羊全血,用pH值7.2的PBS 3 000 r/min離心10 min,洗滌3次后配成10%細胞懸液.取等體積的細胞懸液與1%戊二醛混勻,室溫緩慢攪拌2 h,同法洗滌3次,再用含0.1%NaN3和0.01%硫柳汞的PBS配成2.5%的細胞懸液,然后加入適量鞣酸溶液(用時配制),充分搖勻(37℃,20 min),同法洗滌3次.最后再用PBS配成2.5%紅細胞懸液,4℃保存備用(有效期6個月).

將綿羊紅細胞懸液與不同抗原液等體積混合,于37℃條件下致敏2 h,然后用聚乙二醇兔血清稀釋液洗滌1次,再用含0.1%NaN3、1%胎牛血清的PBS洗滌3次后配成2.5%的紅細胞懸液,即為間接血凝診斷試劑,4℃保存備用.另用上述方法制作一批不經抗原致敏的紅細胞懸液做對照.

1.4間接血凝試驗操作步驟在96孔"V"型血凝板上進行.將陽性血清、陰性血清及待檢血清用PBS作1∶2、1∶4、1∶8……倍比稀釋,最后1孔不加血清作為對照,每孔均為50 μL.然后向試驗孔和對照孔分別加入致敏和非致敏紅細胞懸液50 μL,輕輕振蕩搖晃,置37℃溫箱中2 h,觀察凝集結果. 1.5結果判定紅細胞集中于孔底,呈規則點狀,周圍液體清亮,為陰性.紅細胞均勻鋪于孔底,周圍液體呈云霧狀;或紅細胞凝集成圈;或邊緣有不規則凝集塊等,均為陽性.并按其反應的強度分為"+++"、"++"、"+".

2　結果與分析

2.1抗原制備制備的子孢子、裂殖子抗原液經檢測濃度分別為:0.5 mg/m L和1.4 mg/m L.采用徐賡、周賽等[2]人的方法成功表達EtMIC4-N重組蛋白,其大小約為85 kDa,濃度為0.3 mg/mL.其結果如圖1、2.

圖1　蛋白EtMIC 4-N純化后SDS-PAGE

圖2　W estern B lot檢測

2.2鞣酸最佳濃度的測定為了檢測鞣酸濃度對間接血凝試驗的影響,我們使用10 mg/mL可溶性裂殖子、子孢子蛋白和重組表達的EtMIC4-N蛋白制成抗原診斷液致敏不同鞣酸濃度處理的醛化紅細胞,結果顯示,相較于可溶性的裂殖子與子孢子蛋白,重組蛋白的抗原性更高,并且使用鞣酸處理后能在一定程度上增強紅細胞的吸附作用,根據結果比較后,初步認定鞣酸濃度以1∶2萬即可.其結果如圖3所示.

圖3　不同蛋白不同鞣酸濃度試驗

2.3不同抗原最佳濃度的測定經過測定采用12.5 μg/mL的EtMIC4-N蛋白(抗原3),100 μg/mL的子孢子(抗原1)、裂殖子蛋白(抗原2)作為抗原液致敏紅細胞,血清稀釋陽性結果均在1∶1 024或以上,空白血清及陰性血清均為陰性,因此選擇上述抗原稀釋液為最佳稀釋度,具體結果如表1.

表1　不同抗原最佳濃度的選擇

2.4特異性檢測經過與雞大腸桿菌陽性血清、堆型艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲陽性血清反應后,結果顯示,大腸桿菌為陰性,當使用EtMIC-4蛋白與堆型艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲陽性血清作用后,效價最高不超過1∶4,裂殖子、子孢子可溶性蛋白效價最高不超過1∶8,正常陽性血清效價可達到1∶1 024,初步說明該方法特異性較良好.

3　結論與討論

間接血凝試驗目前已廣泛用于蛔蟲、瘧疾、旋毛蟲、附紅細胞體、錐蟲等的研究[3-4],目前對于其在球蟲上的研究很少,本試驗采用3種不同抗原致敏紅細胞,檢測雞柔嫩艾美耳球蟲免疫后的血清抗體水平,均有較為良好的結果.其中,子孢子和裂殖子采用DE-52層析法純化,不需要太多的專門儀器設備,分離后的子孢子和裂殖子可以用戊二醛處理,抗原性基本不變,在4℃條件下可保存1年以上,但存在分離較為費時費力,且所得的可溶性蛋白成分變化較大等缺點.EtMIC4蛋白為子孢子裂殖子階段均有的蛋白[5-6],經原核表達后可大量獲得,經Western-Blot檢測其可以與柔嫩艾美耳球蟲二免后的雞血清發生陽性反應,表明其具有良好的反應原性,可以作為血清抗體的檢測抗原,但其保存條件要求較高,需要在-80℃保存,且一般不能不超過3個月,并應當避免反復凍融.

本試驗是采用戊二醛醛化紅細胞,雖然醛化后的紅細胞穩定性較好,但只能保存6個月,仍有待進一步改進.經戊二醛處理后的紅細胞再經鞣酸處理,可以增加其吸附抗原的能力,試驗結果表明,鞣酸處理后紅細胞吸附能力在一定程度上與鞣酸濃度呈正比,為準確性和節省材料,經過試驗確定為1∶2萬.

本試驗以陰陽性血清的測定結果結合特異性試驗結果來確定IHA的判定標準,即:當被檢血清效價超過1∶64時,為陽性,否則為陰性.此判定結果確保試驗兼具準確性與特異性.試驗的特異性試驗僅檢測了3種血清,而該方法是否與其他疾病血清反應仍有待進一步研究.

[1]秦睿玲,張西臣,李建華,等.柔嫩艾美耳球蟲間接ELISA檢測方法的建立[J].中國獸醫科技,2004(7):60-63.

[2]王衛婷,姚鵬,周賽.柔嫩艾美耳球蟲MIC4-N的表達[J].北京農學院學報,2011(03):29-32.

[3]張守發,張國宏,汪明,等.應用間接血凝試驗診斷豬附紅細胞體病[J].中國獸醫雜志,2004,40(8):17-19.

[4]何光志,田維毅,簡昌友.應用間接血凝試驗(IHA)診斷豬蛔蟲病[J].貴州農業科學,2010,38(8):153-154.

[5]Periz J,Gill A C,Knott V,et al.Calcium binding activity of the epidermal growth factor-like domains of the apicomplexan microneme protein EtMIC4[J].Mol Biochem Parasitol,2005,143:192-199.

[6]Periz J,Gill A C,Hunt L,et al.The microneme proteins EtMIC4 and EtMIC5 of Eimeria tenella form a novel,ultra-high molecular mass protein complex that binds target host cells[J].J Biol Chem,2007,282 (23):16891-16898.

Establishment of indirect hemagglutination for detection of antibodies against chicken Eim eria tenella

WANG Li-xia1,LIU Xin-yue2,SONG Li-cong2,ZHAO Chen-lu2,ZHANG Jian-jun2,AN Jian2
(1.Beijing Vocational College of Agriculture,Beijing 102442,China; 2.College of Animal Science and Technology,Beijing University of Agriculture,Beijing 102206,China)

To quickly detect the specific serum antibody levels in Eimeria tenlla infected chickens,sporozoites and merozoites were purified by DE-52,and then sonicated to obtain the soluble protein.EtMIC4-N protein was expressed in Escherichia coli ex?pression system,and the glutaraldehyde fixed red cells was sensitized with those proteins.The positive serum was separated from Ei?meria tenlla infected chickens,and the negative serum was separated from SPF chickens.And the indirect hemagglutination diagnos?tic reagent was established.The results showed that co-processing of 100 μg/m L soluble merozoites or sporozoite proteins or 10 μg/ mL EtMIC4-N protein with a dilution ratio of 1:20 000 tanned erythrocytes could occur strong reaction with positive serum,but negative serum and Escherichia coli positive serum have no response.Eimeria acervulina,and Eimeria maxima positive sera had a weak reaction.

Chicken;Eimeria tenlla;IHA

AN Jian

S858.31

A

0529-6005(2016)02-0031-03

2014-12-29

北京農業職業學院技術研究與示范推廣項目(XFYF-14-09)

王黎霞(1986-),女,講師,碩士,主要從事獸醫寄生蟲與分子生物學研究,E-mail:854544702@qq.com

安健(1968-),E-mail:anyh001@bac.edu.cn