含雙膦酸基團的鉑配合物的設計合成及抗腫瘤活性研究

孫艷艷，陳 蕾，吳希雯，丁 倩

(蘇州科技大學 化學生物與材料工程學院，江蘇 蘇州 215009)

科研與開發

含雙膦酸基團的鉑配合物的設計合成及抗腫瘤活性研究

孫艷艷，陳 蕾，吳希雯，丁 倩

(蘇州科技大學 化學生物與材料工程學院，江蘇 蘇州 215009)

設計并合成一系列含雙膦酸基團的乙二胺衍生物及其鉑配合物，通過核磁、質譜及元素分析對化合物進行結構表征，并通過CCK-8法測定其對卵巢癌及骨肉瘤細胞系的體外抗腫瘤活性，篩選出高活性的典型化合物，為后期研究奠定基礎。

鉑配合物；雙膦酸；抗腫瘤

1978年美國FDA批準上市的順鉑是臨床上用于治療睪丸癌及卵巢癌的首選化療藥物，并且對骨肉瘤、子宮頸癌、乳腺癌等實體瘤有明顯療效[1]。然而，由于順鉑的水溶性差、腫瘤選擇性低等特點導致其在臨床上的應用受到很大的限制包括具有嚴重的毒副作用及耐藥性[2]。因此研究開發具有腫瘤靶向性的高效低毒的新型鉑類抗腫瘤藥物至關重要，從而降低化療藥物的毒副作用，提高腫瘤選擇性。將具有骨靶向性的功能性基團引入到鉑配合物中是一種有效的研究策略。雙膦酸基團是一種具有骨靶向性的典型基團，已有文獻報道其對骨質磷灰石具有較高的親和性，從而顯示出對骨質及相關骨組織的高度靶向性[3]。許多含有雙膦酸基團的藥物對骨質疏松癥、骨髓瘤、高血鈣癥以及 Paget癥顯示出較好的療效[4]。早在1990年，Keppler課題組設計一類含有膦酸基團的鉑配合物，針對轉移骨肉瘤顯示較高的體外及體內細胞毒活性[5]。Natile課題組將雙膦酸引入到鉑配合物的離去基團中并發現不同于順鉑的作用機理[6]。Bose團隊研究開發的鉑-焦磷酸配合物對卵巢癌顯示出非DNA共價結合的作用機制[7]。國內的研究者也取得了一些進展，包括南京大學的郭子建教授和廣西師范大學的梁宏教授，分別設計并合成以含有雙膦酸或單膦酸基團的吡啶衍生物為載體配基的鉑配合物，并顯示對人骨肉瘤細胞較高的毒活性[8-9]。

本文設計并合成以含有N,N'-二雙膦酸基的乙二胺衍生物為載體配基的鉑配合物，并對其體外抗腫瘤活性進行初步評價。這種含有對稱性的兩個雙膦酸基團的鉑配合物目前尚未見報道。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

實驗中所有化學試劑均為分析純，氯亞鉑酸鉀采購于昆明鉑銳金屬材料有限公司。制備鉑配合物時需避光通氮氣保護。生物測試中的細胞株培養基均用RPMI-1640。CCK-8試劑盒采購于碧云天。

核磁共振儀(Bruker Avance III HD 400 MHz)，液質聯用儀(Agilent 6230 Accurate-Mass TOF LC/MS)，元素分析儀Vario EL (Elementar)。

1.2 實驗步驟

1.2.1 配體及鉑配合物的制備及表征

配體的制備：中間體M1的制備參考Hoechst前期研究工作[10]。1 mol的M1溶解在6 mol的85%亞磷酸和500 mL氯苯中，加熱至100 ℃，逐滴滴加4 mol三氯化磷，攪拌1 h產生大量黃色沉淀，不需攪拌加熱5 h，輕輕倒出氯苯，將剩余物減壓蒸餾除去溶劑，加入1000 mL水，加熱回流1 h，再加入活性炭攪拌10 min，過濾，減壓濃縮得到粗產物，用水-丙酮重結晶得到白色固體的化合物L1，產率25%。化合物L2和L3的制備方法如上所示,見圖1。

化合物 L1：白色固體(產率25%)。1H NMR (d6-DMSO):δ 2.59～2.82 (m, 8H, CH2),5.64～5.68 (m, 2H, NH),6.50 (s, 2H, COH),11.95 (s, 8H, POH) ppm;31P NMR (d6-DMSO):17.42 ppm;HRMS:m/z [M-H]-calcd. for C6H19N2O14P4:466.97867, found:466.97778; Anal. calcd for C6H20N2O14P4:C15.39, H 4.31,N 5.98,found:C 15.33, H 4.35, N 5.94。

化合物L2：白色固體(產率31%)。1H NMR (d6-DMSO): δ 1.78 (t, 4H, CCH2), 2.61～2.85 (m, 8H, NCH2), 5.63～5.67 (m, 2H, NH), 6.46 (s, 2H, COH), 11.90 (s, 8H, POH) ppm;31P NMR (d6-DMSO): 17.44 ppm; HRMS: m/z [M-H]-calcd. for C8H23N2O14P4:495.00997, found: 495.00915. Anal. calcd for C8H24N2O14P4:C 19.37, H 4.88, N 5.65, found: C 19.32, H 4.85, N 5.70。

化合物 L3：淺黃色固體(產率40%)。1H NMR (d6-DMSO): δ 1.65～1.85 (m, 8H, CCH2CH2), 2.65～2.87 (m, 8H, NCH2), 5.60～5.64 (m, 2H, NH), 6.48 (s, 2H, COH), 11.92 (s, 8H, POH) ppm;31P NMR (d6-DMSO): 17.45 ppm; HRMS: m/z [M-H]-calcd. for C10H27N2O14P4:523.04127, found: 524.04285. Anal. calcd for C10H28N2O14P4:C 22.91, H 5.38, N 5.34, found: C 22.97, H 5.35, N 5.30。

配合物的制備：化合物L1-L3 (2 mmol)溶解在60 mL氯仿中，加入K2PtCl4(0.83 g, 2 mmol)，室溫下攪拌反應20 h，避光通氮氣保護。過濾得黃色澄清溶液，減壓濃縮至少量溶劑，4 ℃冷卻過夜，析出黃色固體，過濾，干燥，得配合物1-3，產率62%～76%。

配合物1：黃色固體 (1.10 g, 65%)。1H NMR (d6-DMSO): δ 2.40～2.65 (m, 8H, CH2), 4.74～4.79 (m, 2H, NH), 5.90 (s, 2H, COH), 11.74 (s, 8H, POH) ppm;31P NMR (d6-DMSO): 21.60 ppm; HRMS: m/z [M-Cl]+calcd. for C6H20N2O14P4ClPt: 697.92013, found: 697.921645. Anal. calcd for C6H20N2O14P4Cl2Pt: C 9.82, H 2.75, N 3.82, Pt 26.57, found: C 9.90, H 2.71, N 3.85, Pt 26.50。

配合物2：黃色固體 (1.25 g, 72%)。1H NMR (d6-DMSO): δ 1.65 (t, 4H, CCH2), 2.44～2.70 (m, 8H, NCH2), 4.60～4.65 (m, 2H, NH), 5.86 (s, 2H, COH), 11.70 (s, 8H, POH) ppm;31P NMR (d6-DMSO): 21.55 ppm; HRMS: m/z[M-Cl]+calcd. for C8H24N2O14P4ClPt: 725.95143, found: 725.95198. Anal. calcd for C8H24N2O14P4Cl2Pt: C 12.61, H 3.17, N 3.68, Pt 25.60, found: C 12.68, H 3.15, N 3.65, Pt 25.67。

配合物3：黃色固體 (1.23 g, 68%)。1H NMR (d6-DMSO): δ 1.57～1.76 (m, 8H, CCH2CH2), 2.38～2.64 (m, 8H, NCH2), 4.70～4.76 (m, 2H, NH), 5.88 (s, 2H, COH), 11.73 (s, 8H, POH) ppm;31P NMR (d6-DMSO): 21.40 ppm; HRMS: m/z [M-Cl]+calcd. for C10H28N2O14P4ClPt:753.98273, found: 753.98304. Anal. calcd for C10H28N2O14P4Cl2Pt: C 15.20, H 3.57, N 3.55, Pt 24.69, found: C 15.26, H 3.52, N 3.58, Pt 24.60。

1.2.2 體外活性測試

通過CCK-8法對配體L1-L3及配合物1-3的體外抗腫瘤活性進行測試。將96孔板每孔放置4000細胞/孔，37 ℃，5% CO2條件下無菌培養24 h。所以待測化合物預溶于超純水中，再用培養基溶解至所需濃度。將藥物溶液加入96孔板中，37 ℃，5% CO2條件下無菌培養48 h，加入10 μLCCK-8溶液，孵育4 h。450 nm波長下測定水溶性甲瓚的吸光度，并計算細胞存活率，將存活率(%)與化合物濃度(μM)作圖，得到IC50值。

圖1 配體L1-L3的合成

2 結果與討論

2.1 化合物的合成與表征

以乙二胺與氯乙酸為原料，氫氧化鋁為縛酸劑制備中間體M1，并以亞磷酸和三氯化磷為磷酸化試劑對中間體M1進行磷酸化反應，得到配體L1，其他配體制備如上所述(圖1)。以配體L1-L3與K2PtCl4為原料制備最終產物1-3(圖2)。所有化合物均通過核磁共振氫譜、磷譜、元素分析及高分辨質譜進行表征，譜圖數據均與結構一致。

圖2 配合物1-3的合成2.2 體外細胞毒活性

通過CCK-8法對配體L1-L3、配合物1-3及陽性對照順鉑和唑來膦酸進行卵巢癌SKOV3及骨肉瘤細胞系MG-63的體外細胞毒活性測試，結果如表1所示。從表中的IC50值可知,鉑配合物1-3的細胞毒活性比雙膦酸配體L1-L3(IC50 = 10.21-32.91 μM)整體較高，說明雙膦酸基團和鉑單元共同發揮抗腫瘤協同作用。對SKOV3細胞系而言，配合物2的活性(IC50 = 12.70 μM)與陽性對照順鉑相當，且是唑來膦酸活性的兩倍；針對骨肉瘤MG-63細胞系，配合物2的活性(IC50 = 10.21 μM)與陽性對照順鉑、唑來膦酸相當。由此可見，配合物2顯示出對兩種細胞系較高的細胞毒活性，是一種潛在的高效抗腫瘤試劑，為下一步體內活性測試提供依據。

表1 配體及配合物的IC50值

3 結論

本文設計并合成了一系列含對稱的雙膦酸取代基的乙二胺配體及其鉑配合物，研究所有化合物對卵巢癌及骨肉瘤兩種細胞系的細胞毒活性。通過IC50值結果可知，鉑配合物比雙磷酸配體具有更高的體外抗腫瘤活性，表明雙膦酸基團與鉑單元發揮抗腫瘤協同作用，并從所有化合物中篩選出具備較高細胞毒活性的典型化合物2，為后續體內活性研究提供理論依據。

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(本文文獻格式：孫艷艷，陳 蕾，吳希雯，等.含雙膦酸基團的鉑配合物的設計合成及抗腫瘤活性研究[J].山東化工，2016，45(24)：1-2，5.)

Synthesis and Antitumor Activity of Platinum-based Complexes with Bisphosphonate Groups

Sun Yanyan,Chen Lei, Wu Xiwen, Ding Qian

(School of Chemistry Biology and Material Engineering, Suzhou University of Science and Technology, Suzhou 215009, China)

A series of ethylenediamine derivatives containing bifunctional bisphosphonate substituents and their corresponding dichloroplatinum(II) complexes have been synthesized and characterized by elemental analysis,1H NMR,31P NMR, and HRMS spectra. All the compounds were tested for their in vitro cytotoxicity by CCK-8 assay against SKOV3 and MG-63. It can be found that representative complex 2 with high cytotoxicity has been screened as a potential antitumor agent for subsequent in vivo study.

platinum(II) complexes; bisphosphonate; antitumor

2016-10-31

國家自然科學基金青年項目(21401137)，江蘇省大學生創新創業訓練計劃項目(201510332057X)

孫艷艷(1985—)，女，講師，主要研究方向：藥物化學。

R943；0641.4

A

1008-021X(2016)24-0001-02