β-欖香烯對人肝癌細胞HepG2增殖的影響及機制探討

張義敏，田明濤，李萍，唐承

(1 山東中醫藥大學，濟南250355；2 威海市胸科醫院)

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·基礎研究·

β-欖香烯對人肝癌細胞HepG2增殖的影響及機制探討

張義敏1，2，田明濤2，李萍2，唐承2

(1 山東中醫藥大學，濟南250355；2 威海市胸科醫院)

目的觀察β-欖香烯對人肝癌細胞株HepG2增殖的影響，并探討其作用機制。方法取對數生長期HepG2細胞分為A、B、C、D組，分別置于含10%胎牛血清RPMI 1640培養基、5 μg/mL β-欖香烯+10%胎牛血清RPMI 1640培養基、10 μg/mL β-欖香烯+10%胎牛血清RPMI 1640培養基、20 μg/mL β-欖香烯+10%胎牛血清RPMI 1640培養基中培養。采用MTT法檢測培養0、24、48、72 h時細胞增殖抑制率，采用RT-PCR法檢測各組培養24 h時細胞軸蛋白(Axin)、結腸腺瘤息肉易感基因(APC)蛋白和β-連環蛋白(β-catenin) mRNA 。結果培養0、24、48、72 h各組細胞增殖抑制率均B組B組>C組>D組，各組細胞Axin、APC mRNA相對表達量為A組

肝癌；β-欖香烯；Wnt/β-catenin信號通路；軸蛋白；結腸腺瘤息肉易感基因；β-連環蛋白

原發性肝癌是我國常見的惡性腫瘤，病死率居惡性腫瘤的第3位[1]。肝癌的發生與病毒感染、肝硬化、攝入黃曲霉素、環境污染等有關，目前尚無有效治療方法[2]。近年研究發現,多種信號轉導通路與原發性肝癌的發生密切相關。Wnt/β-連環蛋白(β-catenin)信號轉導通路(經典Wnt通路)在生物發育、細胞轉運、凋亡等過程中發揮重要作用[3]，其異?；罨c腫瘤的發生、發展關系密切[4]。軸蛋白(Axin)、結腸腺瘤息肉易感基因(APC)蛋白和β-catenin是Wnt信號通路中的重要組成因子。莪術是我國姜科植物蓬莪術或溫郁金、廣西莪術的根莖，具有行氣破血、消積止痛的功效，以往常用于治療癥瘕痞塊、瘀血經閉、胸痹心痛、食積脹痛[5]?，F代藥理研究發現，莪術具有抗腫瘤作用[6]。莪術根莖提取物β-欖香烯是莪術抗腫瘤的3種有效成分之一，可抑制腫瘤細胞的增殖，但其具體作用機制目前尚不明確。2014年8月～2015年11月，我們觀察了β-欖香烯對體外培養的人肝癌細胞HepG2增殖的影響，并探討其可能機制?，F報告如下。

1　材料與方法

1.1材料HepG2購自中國科學院上海生化所細胞庫，RPMI 1640培養基與胎牛血清均購自Gibco公司，β-欖香烯購自中國藥品生物制品檢定所(NICPBP)，兔抗β-catenin、Axin、APC多克隆抗體購自Santa Cruz Biotech公司；鼠抗β-catenin、Axin、APC購自Beyotime公司。Tris、DTT、SDS、Nuclease Mix等購自美國Sigma公司，Immobiline Drystrip Cover Fluid、Immobiline Drystrip PH3-10NL等購自美國GE公司，Temed、CHAPS、 Electrophoresis Regent(T9281)購自美國Simga公司，CCK-8試劑盒購自江蘇碧云天公司。

1.2細胞分組及干預取對數生長期HepG2細胞，置于含10%胎牛血清的RPMI 1640體外培養基，37 ℃、5%CO2、飽和濕度無菌培養箱中培養。將細胞分為A、B、C、D組，分別置于含10%胎牛血清RPMI 1640培養基、5 μg/mL β-欖香烯+10%胎牛血清RPMI 1640培養基、10 μg/mL β-欖香烯+10%胎牛血清RPMI 1640培養基、20 μg/mL β-欖香烯+10%胎牛血清RPMI 1640培養基中培養。

1.3HepG2細胞增殖觀察采用MTT 法。取各組對數生長期細胞接種于96孔板，3×103/孔，每組6個復孔。分別于培養0、24、48、72 h后加入10 μL CCK-8，2 h后用酶標儀檢測波長450 nm處光密度(OD)值。以A組為對照，計算各組細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(OD對照-OD觀察)/OD對照×100%。實驗共重復3次。

1.4HepG2細胞β-catenin、Axin、APC mRNA檢測采用RT-PCR法。取各組培養24 h時對數生長期細胞，TRIzol法提取總RNA，反轉錄合成cDNA，采用sybr染色相對定量目標基因的表達，具體實驗步驟與條件參考文獻進行[7]，引物購自克勞寧生物科技有限公司，以β-actin為內參。β-catenin上游引物5′-ATGACTCGAGCTCAGAGGGT-3′，下游引物5′- ATTGCACGTGTGGCAAGTTC -3′；Axin上游引物5′-ACCGAAAGTACATTCTTGATAAC-3′，下游引物5′-TCCATACCTGAACTCTCTGC-3′；APC上游引物5′-GGATGGAGAAGGCGAAAGTGAG-3′，下游引物5′-TTGCCAAAGGGTAGGGAAATG-3′。以反轉錄獲得的cDNA為模板，分別擴增Axin、APC和β-catenin，復性溫度分別為52 ℃、52 ℃、55 ℃，循環數均為30次。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳(100 V、30 min)后，用BioImaging system觀察成像。用NIH image software分析產物帶灰度，以產物帶與β-actin條帶的灰度比值表示該基因的相對表達量，實驗重復3次。

2　結果

2.1各組細胞增殖抑制率比較見表1。

表1　各組細胞增殖抑制率比較

注：與B組比較，*P<0.05；與C組比較，#P<0.05；與同組前一時點比較，☆P<0.05。

2.2各組細胞β-catenin、Axin、APC mRNA表達比較見表2。

表2　培養24 h時各組細胞β-catenin、Axin、APC mRNA相對表達量比較

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，△P<0.05。

3　討論

中藥單體或復方抗腫瘤的確切療效已得到國際公認，是近年來研究熱點。中藥可作用于腫瘤發生、發展的多個環節，具有多靶點、多環節、多效應的特點。其在抑制、殺傷腫瘤細胞、改善癥狀與體征，以及減輕放化療不良反應、延長患者生存期等方面發揮重要作用；同時，具有不良反應少，能提高機體免疫力，不易產生耐藥性等特點。β-欖香烯是莪術主要成分之一，是臨床用于治療惡性漿膜腔積液、肺癌、消化道腫瘤、腦瘤以及其他淺表性腫瘤的潛在新藥，具有很強殺滅腫瘤細胞及抑制腫瘤生長作用[8]。研究發現，欖香烯聯合TACE治療肝癌可增加腫瘤反應率，延長腫瘤進展時間，并能夠有效改善肝癌患者的生存質量[9，10]，但其具體機制尚有待探討。

Wnt/β-catenin信號通路在腫瘤的發生、發展及預后中起著重要的作用，針對Wnt/β-catenin信號通路中的關鍵分子靶向治療肝癌，已成為肝癌治療的新方向[11]。β-catenin/T細胞可調節Wnt靶基因的表達，其中β-catenin是正向調節因子，APC、Axin在Wnt信號轉導通路中起負向調節作用[12，13]。研究認為，β-catenin基因是一種原癌基因，其表達產物β-catenin主要位于細胞膜，是Wnt信號通路的關鍵調節因子，決定著Wnt信號的開放或關閉。正常情況下，β-catenin介導Wnt信號從細胞膜到細胞質及細胞核的傳遞，從而使Wnt信號轉導通路得以啟動激活并順利進行[14]。在異常Wnt信號通路中，β-catenin降解障礙致使細胞質內游離的β-catenin積聚并進入細胞核，并最終導致癌變的發生[15]。APC蛋白是一個多功能蛋白，可作為一個多種蛋白質復合物相互連接的骨架，在細胞周期、運動、黏附以及信號傳導過程中發揮著重要作用，是Wnt信號轉導通路的重要組成分子[16]。APC蛋白可控制β-catenin在細胞內的含量,在正常細胞內通過與Axin、GSK-3β蛋白結合，促進β-catenin在細胞內的降解[17]。APC基因突變或蛋白異?？墒筗nt信號轉導通路異常激活，引起多種原癌基因持續轉錄而最終導致腫瘤的發生[18]。Axin與APC一樣，是一種重要的骨架蛋白，是支架蛋白復合體的構建基礎，同時通過Wnt信號轉導途徑參與一系列生物學效應的調控,如體軸發育、細胞死亡、神經元的分化等，是一個新發現的腫瘤抑制因子[19]。Axin在各種腫瘤組織中存在不同情況的突變，其無法發揮在Wnt信號傳導通路的調節作用，使細胞正常凋亡無法繼續進行，引起腫瘤細胞異常增殖。

本研究發現，培養0、24、48、72 h,各組細胞增殖抑制率均為B組B組>C組>D組，β-catenin、Axin、APC mRNA相對表達量為A組

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唐承(E-mail: tangcheng968@126.com)

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A

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2016-03-18)