參附注射液對腎母細胞瘤細胞增殖、凋亡的影響及機制探討

仲智勇,時保軍,周輝,王文博

(河北醫科大學第二醫院，石家莊050017)

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參附注射液對腎母細胞瘤細胞增殖、凋亡的影響及機制探討

仲智勇,時保軍,周輝,王文博

(河北醫科大學第二醫院，石家莊050017)

目的觀察參附注射液對腎母細胞瘤細胞增殖及凋亡的影響，并探討其機制。方法取適量對數生長期腎母細胞瘤細胞，分為低、中、高濃度組及對照組。低、中、高濃度組分別加入0.4、0.8、1.2 mg/mL參附注射液2 mL,對照組加入等量無菌DMSO培養液。干預24 h時采用MTT法檢測各組細胞增殖抑制率，采用流式細胞儀測算各組細胞凋亡率，采用Western blot法檢測各組細胞p53、B細胞淋巴瘤因子l-2(bcl-2)蛋白。結果干預24 h時低濃度組、中濃度組、高濃度組、對照組的細胞增殖抑制率分別為22.83%±5.18%、35.76%±6.01%、54.51%±9.07%、6.39%±2.81%，組間比較，P均<0.05。干預24 h時低濃度組、終濃度組、高濃度組、對照組的細胞凋亡率分別為14.59%±1.24%、18.27%±1.73%、21.85%±1.62%、3.92%±1.36%，組間比較，P均<0.05。各組細胞p53的相對表達量為高濃度組<中濃度組<低濃度組<對照組，P均<0.05；bcl-2 的相對表達量為高濃度組>中濃度組>低濃度組>對照組，P均<0.05。結論參附注射液可抑制腎母細胞瘤細胞增殖，促進細胞凋亡；其機制可能與降低p53表達、升高bcl-2表達有關。

參附注射液；腎母細胞瘤；細胞增殖；細胞凋亡；p53；B細胞淋巴瘤因子-2

腎母細胞瘤是小兒常見的腎臟惡性腫瘤，占兒童腎臟腫瘤的95%[1]。目前，臨床常用的治療方式有手術、放化療等，但并發癥較多。尋找敏感且不良反應較少的抗腎母細胞瘤藥物是目前的研究熱點。參附注射液源自古文“參附湯”，由紅參、黑附片兩味藥經現代提取工藝提取制成，主要含人參皂苷、人參三醇和烏頭堿等生物活性成分，具有回陽救逆、益氣固脫作用，可增強心肌收縮力、清除氧自由基，另具有調節機體及抗腫瘤等作用[2,3]，已廣泛應用于心血管、呼吸系統疾病的治療。p53和B細胞淋巴瘤因子-2(bcl-2)是臨床常用的細胞凋亡指標。近年研究顯示，參附注射液對肺癌、食管癌、胃癌、腸癌、肝癌、乳腺癌和卵巢癌等腫瘤均有一定的臨床效果[4]，但對于腎母細胞瘤的相關報道較少。2014年3～12月，我們觀察了參附注射液對腎母細胞瘤細胞增殖、凋亡的影響，并探討其可能的作用機制?，F報告如下。

1　材料與方法

1.1材料腎母細胞瘤細胞由中國科學院細胞度提供；參附注射液購自雅安三九藥業有限公司；bcl-2羊抗人多克隆抗體、鼠抗人p53單克隆抗體勻購自美國Santa Cruz公司，免疫組化ABC試劑盒、DAB顯色試劑盒購自廣州華美生物工程公司;熒光標記兔抗羊IgG購自上海微蒙生物技術有限公司，PVDF膜購自Sigma公司,基因組DNA抽提試劑盒購自艾美捷科技有限公司；Annexin V-FITC流式試劑盒購自上海前塵生物科技有限公司，ECL發光試劑盒購自上海通善生物科技有限公司，核酸電泳儀、轉膜電泳儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2細胞分組及干預取適量對數生長期腎母細胞瘤細胞接種于96孔板，1.0×104/孔。將細胞分為低、中、高濃度組及對照組4組，每組6個復孔，低、中、高濃度組分別加入0.4、0.8、1.2 mg/mL參附注射液2 mL,對照組加入等量無菌DMSO培養液，置于37 ℃、5 %CO2恒溫培養箱中培養24 h。

1.3細胞增殖抑制率檢測采用MTT法。取干預24 h各組對數生長期細胞， 1.0×104/孔接種于96孔板中，每組5個復孔。培養24 h時加入5 mg/mLMTT 20 μL， 4 h后棄上清液，加入200 mL DMSO振蕩。用酶標儀檢測各組細胞吸光度OD值，計算各組細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=1-(觀察組OD值/ 空白組OD值)×100%。實驗共重復3次。

1.4細胞凋亡率測算采用流式細胞儀。收集干預24 h對數生長期各組細胞，調整細胞密度為1×104/mL，接種于6孔板，每組6個復孔。PBS洗2次，1 000 r/min離心10 min，加入結合緩沖液 200 mL 、Annexin V-FITC 10 μL，室溫下避光放置15 min，加入結合緩沖液300 mL、PI 5 μL，混勻后在流式細胞儀上檢測細胞的凋亡率。細胞凋亡率=凋亡細胞數/(凋亡細胞數+正常細胞數)×100%。實驗共重復3次。

1.5細胞p53、bcl-2 蛋白檢測采用Western blot法。取干預24 h時各組對數生長期細胞， 1.0×105/孔接種于6孔板中，每組6個復孔。PBS沖洗3遍，裂解、13 000 r/min、4 ℃離心5 min，精密移取上清液。用瓊脂糖凝膠電泳，取下凝膠，PVDF膜300 mA 轉膜110 min，加入適量的封閉液封閉60 min，再分別用封閉液稀釋抗p53、bcl-2多克隆抗體濃度至0.1 μg/mL，加到PVDF膜的正面，4 ℃冷藏過夜，PBS沖洗5 min，連續沖洗5次。將兔抗羊IgG用5%脫脂奶粉封閉液稀釋2 000倍，置于PVDF膜中,25 ℃下放置60 min， PBS沖洗5 min，連續沖洗5次。以β-actin為內參，采用凝膠圖像分析儀分析各組p53、bcl-2 蛋白表達條帶的光密度，以目的蛋白與內參灰度比值來表示目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

2　結果

2.1各組細胞增殖抑制率比較干預24 h時低濃度組、中濃度組、高濃度組、對照組的細胞增殖抑制率分別為22.83%±5.18%、35.76%±6.01%、54.51%±9.07%、6.39%±2.81%，組間比較，P均<0.05。

2.2各組細胞凋亡率比較干預24 h時低濃度組、終濃度組、高濃度組、對照組的細胞凋亡率分別為14.59%±1.24%、18.27%±1.73%、21.85%±1.62%、3.92%±1.36%，組間比較，P均<0.05。

2.3各組細胞p53、bcl-2 蛋白表達量比較各組細胞p53的相對表達量為高濃度組<中濃度組<低濃度組<對照組，P均<0.05；bcl-2 的相對表達量為高濃度組>中濃度組>低濃度組>對照組，P均<0.05。見表1。

表1　干預24 h各組細胞p53、bcl-2 蛋白相對表達量比較

注：與對照組比較,*P<0.05；與低濃度組比較，#P<0.05；與中濃度組比較，ΔP<0.05。

3　討論

腎母細胞瘤的發病因素涉及多個基因[5]，與腫瘤的發生、發展有密切的聯系。p53基因是腫瘤領域眾多相關的抑制基因中研究得最為廣泛、最為系統的抑癌基因。p53基因是最早發現的腫瘤抑制基因之一，能調節細胞周期，避免細胞癌變發生。在所有惡性腫瘤中，50%以上會出現該基因的突變。由p53編碼的蛋白質是一種轉錄因子，其控制著細胞周期的啟動。p53基因突變是腫瘤中最常見的分子遺傳學改變[6～8]。輻射誘導的DNA損傷可通過ATM激活p53，阻斷細胞周期，并提高Fas的表達，誘導細胞凋亡。p53基因不僅可促進腫瘤細胞的凋亡，還與細胞對藥物的敏感性有關[9]。p53基因是重要的腎母細胞瘤抑癌基因，研究顯示對化療藥物敏感的腫瘤細胞含有野生型p53基因，而含有突變型p53型基因的腫瘤細胞對化療藥物具有一定的抵抗性。這時，只有加大化療藥物的用量才可激活p53依賴的凋亡作用[10，11]。bcl-2是一種原癌基因,是細胞凋亡的關鍵調節因子[12，13]。細胞接受凋亡信號后，促凋亡因子Bax發生寡聚化，從細胞質中轉移到線粒體外膜上，并與膜上的電壓依賴陰離子通道相互作用，使通道開放到足以使線粒體內的凋亡因子如細胞色素C等釋放到細胞質基質中，引起細胞死亡。研究發現，bcl-2高表達與腫瘤的發生、發展密切相關。bcl-2的過量表達常導致腫瘤細胞對化療藥物的耐藥而阻止細胞凋亡，影響治療效果。bcl-2基因直接或間接使細胞壽命延長，增加遺傳物質突變率及細胞數增多，從而促進腫瘤的發生、發展[14]。國內外研究發現，bcl-2在多種腫瘤中均有表達，如腎癌、胰腺癌、食管癌、淋巴造血組織、胃癌等[15～17]。

參附注射液可誘導多種腫瘤細胞的凋亡，抑制腫瘤細胞的增殖，其機制可能與其阻斷多能干細胞的增殖，抑制腫瘤細胞內I-κB免疫抑制因子的表達，抑制TNF-α的表達有關。藥理研究顯示，參附注射液可抑制大鼠缺血性腦損傷神經元凋亡，可能是與參附注射液上調bcl-2蛋白表達及下調p53蛋白表達有關[18]。臨床研究顯示，參附注射液在一定程度上對惡病質細胞因子具有下調作用，而且可改善患者的厭食等癥狀[19]。參附注射液的主要生物活性成分為人參皂苷、人參三醇和烏頭堿，均可降低Caspase3、7酶活性，顯著下調羥化酶CYP4A1基因表達水平，同時上調bcl-2基因表達，最終下調Bax基因表達[20]。

本研究結果顯示，干預24 h時細胞增殖抑制率和細胞凋亡率均為對照組<低濃度組<中濃度組<高濃度組，p53的相對表達量為高濃度組<中濃度組<低濃度組<對照組，bcl-2 的相對表達量為高濃度組>中濃度組>低濃度組>對照組。因此，參附注射液可抑制腎母細胞瘤細胞增殖,促進細胞凋亡；其具體作用機制可能與其抑制p53表達、促進bcl-2表達有關。

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Effects of Shenfu injection on proliferation and apoptosis of Wilm's tumor cells

ZHONGZhiyong,SHIBaojun,ZHOUHui,WANGWenbo

(TheSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China)

ObjectiveTo investigate the effects and related mechanism of Shenfu injection on the proliferation and apoptosis of Wilm's tumor cells in vitro. MethodsWilm's tumor cells were divided into the control group, low-dose, medium-dose and high-dose groups. The low-dose, medium-dose and high-dose groups were treated with 2 mL of 0.4 mg/mL, 0.8 mg/mL and 1.2 mg/mL Shenfu injection, and the control group was added with DMSO. After 24-hour intervention, the proliferation inhibition rate was detected by MTT, the rate of apoptosis and the expression of p53 and Bcl-2 protein was detected by flow cytometry and Western blotting, respectively.ResultsAfter 24-hour intervention, the proliferation inhibition rates of the low-dose group, medium-dose group, high-dose group and the control group were respectively 22.83%±5.18%, 35.76%±6.01%, 54.51%±9.07% and 6.39%±2.81%, allP<0.05. After 24-hour intervention, the apoptosis rates of the low-dose group, medium-dose group, high-dose group and the control group were 14.59%±1.24%, 18.27%±1.73%, 21.85%±1.62% and 3.92%±1.36%, respectively, allP<0.05. The relative expression of p53 was high-dose groupmedium-dose group>low-dose group>control group, allP<0.05. Conclusion Shenfu injection can inhibit the proliferation of Wilm's tumor cells and induce its apoptosis, and the mechanism may be related with the down-regulated expression of p53 and up-regulated expression of Bcl-2.

Shenfu injection; Wilm's tumor; cell proliferation; apoptosis; p53; B lymphocyte-2

河北省醫學科學研究課題計劃項目(20130151)。

仲智勇(1970-)，男，碩士，副主任醫師，主要研究方向為小兒腫瘤。E-mail： zhongzy2005@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.18.006

R737.1

A

1002-266X(2016)18-0018-03

2016-01-16)