不同濃度白術多糖及培養溫度對牛卵母細胞體外成熟的影響

樊敏歡　許丹寧　田允波

（1.廣東科貿職業學院人文外語系，廣東廣州 510430；2.廣東省水禽健康養殖工程技術研究中心，廣東廣州 510225；3.廣東省水禽健康養殖工程技術研究中心，廣東廣州 510225）

不同濃度白術多糖及培養溫度對牛卵母細胞體外成熟的影響

樊敏歡1許丹寧2田允波3

（1.廣東科貿職業學院人文外語系，廣東廣州 510430；2.廣東省水禽健康養殖工程技術研究中心，廣東廣州 510225；3.廣東省水禽健康養殖工程技術研究中心，廣東廣州 510225）

據大量學者研究表明中藥多糖對細胞的生長、分化及增值都具有明顯的促進作用。本試驗試圖通過在牛卵母細胞體外成熟培養液中加入不同濃度梯度的白術多糖溶液，進而對卵母細胞進行體外成熟培養，從中研究不同濃度白術多糖對卵母細胞體外成熟效果的影響，結果發現低劑量：10～50μg/ml白術多糖對牛卵母細胞體外成熟有促進作用；中劑量：50～100μg/ml白術多糖對牛卵母細胞體外成熟作用不明顯；高劑量：150～200μg/ml白術多糖嚴重抑制牛卵母細胞的成熟，甚至使卵母細胞細胞質皺縮。其二試驗通過提高卵母細胞的培養溫度探索白術多糖對卵母細胞熱應激的作用，結果發現最適濃度白術多糖對卵母細胞高溫培養有一定的保護作用。

牛卵母細胞；白術多糖；體外成熟；熱應激

1 試驗材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1卵巢：取自佛山大瀝錦豐屠宰場的健康屠宰山羊

1.1.2GV期卵母細胞：通過挖卵法取得牛GV期卵母細胞。

1.1.3主要試劑及耗材：

生理鹽水（蘇州海博生物技術有限公司）

磷酸鹽緩沖液（PBS）、雙抗、M-199基礎培養液、胚胎水（賽默飛世爾生物化學制品（北京）有限公司）

發情期山牛血清、胎牛血清、液體石蠟、右旋葡萄糖（廣州蕊特生物科技有限公司）

促黃體素、促卵泡素、透明質酸酶（廣州萊德爾生物科技有限公司）

丙酮酸鈉（廣州鑫邦生物科技有限公司）

80 % 白術多糖（批號：TY20120823）（西安天園生物制劑廠）

以下試劑均購自Sigma公司：胚胎水、NaCl（Sigma S5886）、KCl（Sigma P5405）、NaHCO3（Sigma S5761）、NaH2PO4 H2O （Sigma S9638）、Hepes（Sigma H9136）、Na Lactate（Sigma L1375）、Phenol Red solution（Sigma P0290）、CaCl2·2H2O （Sigma C7902）、MgCl2·6H2O（Sigma M2393）、3 %牛血清蛋白（BSA）（Sigma 4503）

0.22μm針頭過濾器、35 mm細胞培養皿、離心管、10 ml注射器、無菌手套、口罩、帽子等實驗室常規器械及耗材。

1.2試驗方法

1.2.1卵母細胞洗滌液及基礎成熟培養液配制

（1）洗滌液：TL-Hepes液。

（2）卵細胞成熟培養液：TCM199+0.5496 g/L右旋葡萄糖+0.1 g/L丙酮酸鈉+0.075 g/L青霉素+0.05 g/L鏈霉素+10 μg/ml FSH+10 μg/ml LH +10 %發情期山牛血清（牛卵母細胞）（或10 %胎牛血清（牛卵母細胞）），調節pH值為7.2～7.4。

1.2.2牛卵母細胞的采集方法

卵母細胞的采集直徑>2 mm 的卵泡采用注射器抽吸法，直徑＜2 mm 的卵泡采用挖卵針取卵法，收集50個左右的卵泡置于含有1.5ml TL-Hepes液的無菌培養皿中，在體視顯微鏡下檢取卵丘-卵母細胞復合體，選擇 A/B 級卵母細胞用于試驗。

1.2.3卵母細胞培養前洗滌方法

采用微滴法洗滌卵母細胞：35 mm無菌細胞培養皿上，先滴入20μl成熟培養液，覆蓋液體石蠟2.5 ml，在原液滴上追加70μl成熟培養液，微滴總量為90μl，每個培養皿上可放置4個微滴，38.5 ℃、5 % CO2環境孵育4～6 h后備用。

卵母細胞從卵巢取出后，顯微鏡下挑選出A/B級卵母細胞，分別用TL-Hepes微滴洗滌5次，TCM199微滴洗滌5次。

1.2.4白術多糖原液配制方法

準確稱取80 % 白術多糖12.5mg，溶于10 ml胚胎水中，充分混勻，0.22 μm過濾器過濾滅菌，配制成1 mg/ml的白術多糖原液分裝備用（有效期1個月），用時按需要進行稀釋。

1.2.5卵母細胞培養方法

采用大微滴法對卵母細胞進行培養：35 mm無菌細胞培養皿上，先滴入40μl成熟培養液，覆蓋液體石蠟2.5 ml，在原液滴上追加140 μl成熟培養液，微滴總量為180μl，每個培養皿上放置2個微滴。38.5 ℃、5 % CO2環境孵育4～6h備用。

選取洗滌后的A/B級卵母細胞，用撿卵針移入預平衡4～6h 的成熟培養液微滴內進行培養，5 % CO2，相對濕度95 %；24～26 h（牛卵母細胞）后取出觀察結果。

1.2.6卵母細胞成熟判斷方法

將培養20～22h后的卵母細胞移入含有0.2 %透明質酸酶的PBS液中，作用1～2min后，用撿卵針反復吹打，去掉卵母細胞表面包裹的卵丘細胞，用基礎成熟培養液洗滌3次，觀察裸露的卵母細胞，以排出第一極體作為成熟的判定標準，于顯微鏡下計算成熟數及成熟率。

1.3試驗分組設計

1.3.1不同濃度白術多糖對牛卵母細胞體外成熟培養的影響試驗

試驗共分6組，第1組為對照組，卵母細胞成熟培養液成分：基礎成熟培養液+10 μg/ml FSH+10 μg/ml LH；第2～6組為白術多糖組，卵母細胞成熟培養液成分：基礎成熟培養液+10 μg/ml FSH+10 μg/ml LH +（低劑量：10μg/ml、50μg/ml，中劑量：100μg/ml，高劑量：150μg/ml、200μg/ml）白術多糖溶液，具體分組情況如表1所示。

表1　試驗組成熟培養液成分

表2　試驗組培養溫度變化

1.3.2白術多糖對牛卵母細胞體外成熟高溫培養的影響試驗

試驗共6個小組，每小組設置一個對照組及一個試驗組。6個小組的對照組的成熟培養液成分為卵細胞成熟培養液 +0 μg/ml白術多糖，而試驗組的成熟培養液成分為卵細胞成熟培養液 +50 μg/ml白術多糖。分別改變牛卵母體外培養溫度，具體分組情況如下：

2　結果與分析

2.1不同濃度白術多糖對牛卵母細胞體外成熟培養的影響試驗

表3　不同濃度的白術多糖對牛卵母細胞體外成熟率的影響

對369個牛卵母細胞進行體外成熟培養，試驗結果（3）顯示：添加濃度為50 μg/ml時，卵母細胞成熟率最高，顯著高于200μg/ml劑量組（P＜0.05），但與對照組及其他濃度劑量組差異不顯著（P>0.05），添加濃度為200μg/ml時，卵母細胞體外成熟率是所有試驗組中最低的，與對照組差異顯著（P＜0.05）。從整體上看，中、低濃度的白術多糖對牛卵母細胞體外成熟均有較好的促進作用，在100μg/ml時，仍能維持較高的成熟效率，150 μg/ml時雖然成熟率開始下降，但與對照組間無顯著性差異（P>0.05），可見，牛卵母細胞對白術多糖添加濃度的變化耐受范圍較寬。同時可以看出，牛卵母細胞對白術多糖濃度的依賴性較強，僅低濃度的白術多糖可以提高卵母細胞的成熟率，而中、高劑量的白術多糖對卵母細胞的體外成熟均有不同程度的抑制作用；牛卵母細胞在中、低濃度的白術多糖培養液中，體外成熟率較對照組有所提高，僅在高劑量添加時，才對卵母細胞的成熟有所抑制。200μg/ml的白術多糖培養液牛卵母細胞出明顯的抑制作用進而導致卵母細胞嚴重萎縮死亡，這表明白術多糖對卵母細胞體外成熟的促進作用是有明顯的劑量依賴性，并非越多越好，這與培養液成分的相互作用有關。

2.2白術多糖對牛卵母細胞體外成熟高溫培養的影響試驗

在不同濃度的白術多糖對牛卵母細胞體外成熟率的影響的試驗中，初步測得牛卵母細胞體外成熟培養的最適濃度為50 μg/ ml。本試驗試圖提高卵母細胞體外培養溫度，人工制造熱應激，試圖探索白術多糖對卵母細胞體外高溫培養有無保護作用。試驗結果（表4）顯示：培養溫度為38.5℃時，卵母細胞成熟率較其他試驗組高，當溫度上升0.5℃時，對照組牛卵母細胞體外成熟率為0%而添加50μg/ml 白術多糖試驗組牛卵母細胞的成熟率為16.68%。當溫度上升39.5℃時，對照組牛卵母細胞體外成熟率為0%而添加了50 μg/ml 白術多糖試驗組牛卵母細胞的成熟率為0.05%。但溫度高于40℃，無論是試驗組還是對照組均未見卵母細胞成熟。可見白術多糖在卵母細胞體外培養中產生了一定的過熱保護作用，大量研究文獻得出牛卵母細胞體外培養溫度為38.5℃，但在培養液中加入50 μg/ml的白術多糖能拓寬牛卵母細胞體外培養溫度使之能有+0.5～1℃的溫度差范圍。但是培養溫度過高時，本試驗認為高40℃，白術多糖對牛卵母細胞體外成熟培養的保護受抑制，這可能是由于溫度過高是的細胞內酶失去生物活性，從而導致卵母細胞死亡。

3 小結

補益類中藥多糖具有控制細胞分裂、分化、調節細胞生長、衰老的功能，對細胞也有不同程度的保護作用［1-3］。本研究選用白術多糖作為添加物，對牛卵母細胞進行體外培養，旨在探討白術多糖對卵母細胞發育的調控作用，為優化卵母細胞培養體系提供試驗依據。

表4　白術多糖對牛卵母細胞體外成熟高溫培養的影響試驗

3.1不同濃度白術多糖對牛卵母細胞體外成熟培養的影響試驗

目前，哺乳動物卵母細胞成熟培養液均以M-199為基礎培養液，添加生殖激素、血清、生長因子及其他營養成分。成熟培養液的成分根據培養卵母細胞的種類稍有差異。本試驗在培養液中加入含有發情期牛（或胎牛）血清，其目的是由于發情期牛的血清中含有多種出盡卵細胞成熟的激素，添加同源性血清卵母細胞的離體成熟及發育具有重要作用。本試驗還添加低劑量（10、50 μg/ml）、中劑量（100 μg/ml）及高劑量（150、200 μg/ml）的白術多糖溶液，觀察不同白術多糖添加濃度對卵母細胞發育能力的作用，綜合試驗結果得出，于高劑量白術多糖均表現出發育停滯現象，尤其是添加劑量為150 μg/ml以上時，卵母細胞的成熟率顯著下降，鏡檢觀察到大部分卵母細胞出現了皺縮現象，說明高濃度的糖類物質，可能會導致成熟培養液滲透壓發生變化，細胞內水分流失，胞質皺縮，出現發育受阻現象。

有研究人員發現葡萄糖為營養物質培養卵母細胞，高濃度（11.2 mmol/L）葡萄糖對卵母細胞的體外成熟產生抑制，中濃度（5.6 mmol/L）的葡萄糖培養液則可使卵母細胞的成熟率提高；Fraser等分別在不同濃度梯度的 D-葡萄糖的KSOM體外培養基中培養小鼠二細胞，結果發現0.2、5.56 mmol/L培養基中二細胞胚能發育成囊胚，其他高糖濃度的則不能，結果顯示高糖環境對早期著床前胚胎有抑制作用。葡萄糖作為最單純的能量來源，其有效作用濃度應為6.0 mmol/L以下，高于此濃度，卵母細胞成熟率均有下降。這一現象可能與葡萄糖轉運子（glucose transporters，GLUT）有關。GLUT1基因缺乏的胚胎較野生型胚胎的細胞凋亡率要高，畸形胚胎率也高.。糖尿病模型雌鼠早期胚胎細胞中GLUT1、2、3的表達下調，體外培養亦顯示二細胞在高濃度（30、52 mmol/ L）糖培養液中培養72 h，GLUT的mRNA和蛋白表達水平均明顯減少，由于 GLUT的減少使高糖環境下細胞對葡萄糖攝取減少，內部游離血糖水平降低，細胞得不到足夠能量，可能是細胞停滯發育的另一個重要因素。

3.2白術多糖對牛卵母細胞體外成熟高溫培養的影響

卵母細胞在體外繼續發育對生長環境要求非常嚴格，溫度、氣相、培養液的pH值、移動的次數等均可影響卵母細胞的發育能力，本研究采取升高環境溫度的手段，對卵母細胞造成人為有害刺激，以此觀察白術多糖對卵母細胞成熟的保護作用，試驗結果證實，對于牛卵母細胞，但溫度高于39℃，卵母細胞大多停滯發育，但通過在培養液中加入50 μg/ml的白術多糖，能夠很好地保護卵母細胞免受熱應激的影響。在溫度為38.5～39.5℃時，試驗組仍有卵母細胞成熟，這表明白術多糖對于牛卵母細胞抵抗不良環境的能力作用更加顯著。

［1］毛健，馬海樂.靈芝多糖的研究進展［J］.食品科學，2010，31 （1）：295-299.

［2］吳梅，譚睿.黃芪多糖研究進展［J］.川北醫學院學報，2013，28 （1）：17-22.

［3］田允波，許丹寧，黃運茂，等.白術多糖免疫調控作用的研究進展［J］.畜牧與獸醫，2010，42（9）：98-100.

楊琪（1994—），女，本科，研究方向：預防獸醫。