豬流行性腹瀉疫苗免疫母豬后哺乳仔豬免疫效果ELlSPOT和ELlSA檢測(cè)

李凱航周鑫焱楊顯超吳秀娟王 建*

（1.上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103；2.揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

豬流行性腹瀉疫苗免疫母豬后哺乳仔豬免疫效果ELlSPOT和ELlSA檢測(cè)

李凱航1周鑫焱2楊顯超1吳秀娟1王 建1*

（1.上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103；2.揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

豬流行性腹瀉（porcjne epjdemjc djarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcjne epjdemjc djarrhea vjrus，PEDV）引起的豬的一種急性接觸性腸道傳染病，以嘔吐、腹瀉、食欲下降和脫水為基本特征，各年齡段均易感染，尤以哺乳仔豬受害最重。本論文通過調(diào)查上海本地PED的流行情況，用市場(chǎng)上現(xiàn)有的主要PED疫苗免疫母豬，對(duì)窩產(chǎn)仔豬進(jìn)行連續(xù)的免疫反應(yīng)監(jiān)測(cè)，觀察其體液免疫和細(xì)胞免疫的變化，結(jié)合之前監(jiān)測(cè)結(jié)果對(duì)疫苗免疫效果進(jìn)行評(píng)估，為豬場(chǎng)篩選合適疫苗，制定合理的免疫程序，預(yù)防與控制PED提供理論依據(jù)。

豬流行性腹瀉；體液免疫；細(xì)胞免疫；免疫評(píng)估

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus）PEDV所導(dǎo)致的，PEDV是屬于套式病毒目（Nidov hales）冠狀病毒科（Coronaviridae）冠狀病毒亞科（Coronav irinae）甲型冠狀病毒屬（Alphacoronavirus）b亞群的成員。感染豬主要臨床體現(xiàn)為水樣腹瀉、嘔吐和脫水，不同年齡、品種的豬均易感染，對(duì)哺乳仔豬的危害尤其嚴(yán)重。

在PED近年來的綜合防治措施中，母豬返飼和“換奶媽”，豬圈烘干等措施效果時(shí)好時(shí)壞，百家爭(zhēng)鳴，褒貶不一，當(dāng)前，隨著國內(nèi)PED變異株細(xì)胞培養(yǎng)難關(guān)的攻克，該病防治的焦點(diǎn)又重回疫苗的生產(chǎn)上，但因細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的病毒濃度無法達(dá)到生產(chǎn)工藝要求，變異株疫苗尚無商品化疫苗供應(yīng)。養(yǎng)殖戶迫于疫病防控壓力，從多種途徑采購美國進(jìn)口苗、韓國進(jìn)口苗、國內(nèi)廠家正規(guī)疫苗甚至無批號(hào)的“白板苗”，免疫次數(shù)從二免到七免都有，但疫苗免疫效果缺少評(píng)價(jià)。本研究采集上海本市規(guī)模化豬場(chǎng)母豬、育肥豬和仔豬的血清作為實(shí)驗(yàn)樣品，使用商品化的試劑盒檢測(cè)哺乳仔豬血清中的ELISA抗體和外周血細(xì)胞（PBMC）中的γ-干擾素水平，從體液免疫和細(xì)胞免疫兩方面對(duì)免疫效果加以評(píng)估，希望客觀反映疫苗免疫效果。

1 材料和方法

1.1樣品采集

首先對(duì)上海市規(guī)模豬場(chǎng)采集的血清樣品進(jìn)行ELISA抗體摸底調(diào)查，樣品均采自本市各區(qū)縣豬場(chǎng)。對(duì)存欄母豬和育肥豬通過前腔靜脈無菌采集血液，側(cè)放靜置30min，待析出血清后，2000 rpm離心10min，分離血清裝入1.5 ml EP管凍存待檢。

隨后，選擇無流行性腹瀉感染史的豬場(chǎng)，挑選10只頭胎母豬，經(jīng)PCR方法檢測(cè)無疫后分成2組。免疫組：6頭母豬產(chǎn)前按照免疫程序（產(chǎn)前2月和產(chǎn)前1周）進(jìn)行兩次免疫，首免為ZY滅活疫苗，二免為DBN弱毒疫苗，2頭母豬為對(duì)照組，不免疫PED疫苗。母豬產(chǎn)仔后對(duì)窩產(chǎn)哺乳仔豬進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間為產(chǎn)后3 d、6 d、9 d、12d、16 d、19 d和26 d，仔豬每次隨機(jī)挑選5只同步采集血清和全血（肝素鈉為抗凝劑），分別進(jìn)行ELISA和ELISPOT檢測(cè)。

1.2試劑及儀器

1.2.1ELISA試劑及儀器

ELISA檢測(cè)試劑盒購自Biovet公司，批號(hào)：153007，TECAN SUNRISE酶標(biāo)儀。

1.2.2ELISPOT試劑及儀器

ELISPOT試劑盒購自MABTECH公司，批號(hào)：3130-4HPW-2。LSM（Lymphocyte Separation Medium）淋巴細(xì)胞分離液和植物血凝素（Phytohemagglutinin）購自MP公司，細(xì)胞培養(yǎng)的PEDV（2*105TCID50）由實(shí)驗(yàn)室保存，CTL Analyzers LLC ELISPOT計(jì)數(shù)儀。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1ELISA檢測(cè)

按照Biovet公司ELISA試劑盒說明書操作。

1.3.2ELISPOT檢測(cè)

淋巴細(xì)胞分離、孵育及檢測(cè)參照MABTECH試劑盒說明書操作。

2 結(jié)果

2.1規(guī)模豬場(chǎng)免疫效果調(diào)查

對(duì)2014-2015年本市5個(gè)區(qū)縣37個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)的1100頭母豬和710頭育肥豬進(jìn)行PED免疫效果ELISA檢測(cè)，全市PED免疫后，母豬的免疫平均合格率為50.1%，而育肥豬僅為36.4%，母豬的免疫水平明顯高于育肥豬。各區(qū)縣母豬免疫合格率介于26.7～63.3%，育肥豬免疫合格率介于18.3～42.5%，均未能達(dá)到70%的免疫合格線。2015年與2014年檢測(cè)結(jié)果類似，免疫整體水平母豬群高于育肥豬群，各區(qū)縣母豬免疫合格率介于30.0～48.8%，育肥豬合格率介于11.67～31.25%，整體免疫合格率母豬為38.73%，育肥豬為21.13%，整體免疫合格率與2014年同比降低。

2.2血清ELISA檢測(cè)結(jié)果

利用ELISA方法來檢測(cè)豬流行性腹瀉疫苗免疫母豬后窩產(chǎn)仔豬免疫效果，挑選了6頭實(shí)驗(yàn)?zāi)肛i，每頭母豬挑選5只仔豬進(jìn)行母源抗體檢測(cè)，以同一母豬的窩產(chǎn)哺乳仔豬檢測(cè)后的S/P均值為線作圖1。

圖1　實(shí)驗(yàn)仔豬PED母源抗體變化

從圖1中可以看出，仔豬在出生后母源抗體一直處于下降趨勢(shì)，免疫合格判定臨界值為S/P值等于0.5，而67%的窩產(chǎn)仔豬在第9 d時(shí)即抗體轉(zhuǎn)陰，16%的仔豬在9～16 d內(nèi)抗體轉(zhuǎn)陰，所有仔豬在19 d后ELISA抗體均已轉(zhuǎn)陰。由此可知，豬流行性腹瀉疫苗免疫母豬后窩產(chǎn)仔豬免疫效果并不理想，仔豬依然面臨著PEDV感染風(fēng)險(xiǎn)。

2.3全血ELISOPT檢測(cè)結(jié)果

ELISPOT檢測(cè)實(shí)驗(yàn)仔豬全血樣本，斑點(diǎn)數(shù)的多少代表的是仔豬細(xì)胞淋巴細(xì)胞的特異性免疫分泌的γ-干擾素多寡，窩產(chǎn)仔豬斑點(diǎn)數(shù)在0-40之間，陽性斑點(diǎn)在52-179之間。

圖2　ELISPOT陽性對(duì)照斑點(diǎn)圖

圖3　ELISPOT陰性對(duì)照斑點(diǎn)

不同日齡和對(duì)照組一共8組數(shù)據(jù)，為更準(zhǔn)確的判斷出仔豬PED的免疫狀況，借助SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，將對(duì)照組數(shù)據(jù)作為分析對(duì)照，利用LSD法判斷顯著性。均值差的顯著性水平為0.05，置信區(qū)間95%的前提下，日齡為9、12、16d的窩產(chǎn)仔豬的ELISPOT斑點(diǎn)數(shù)均值差與對(duì)照組相比存在一定差異，差異不顯著，說明在細(xì)胞免疫水平上并沒有取得理想的免疫效果。

3 結(jié)論

運(yùn)用ELISA方法對(duì)上海市規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)的生產(chǎn)母豬群和育肥豬群進(jìn)行監(jiān)測(cè)，從抗體免疫水平來看，2014-2015年所監(jiān)測(cè)的37個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)，場(chǎng)合格率僅為5.4%（2/37）。其中，2014年生產(chǎn)母豬群體免疫合格率為50.1 %，育肥豬群36.4 %；2015年生產(chǎn)母豬群群體免疫合格率為38.7%，育肥豬群為21.1 %。免疫合格率生產(chǎn)母豬高于育肥豬0.75 %-32.8 %不等。從本市PED總體免疫效果來看，連續(xù)兩年的監(jiān)測(cè)均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于70%免疫合格線，對(duì)病毒無法起到阻斷傳播作用，容易造成病毒流行散播，一旦出現(xiàn)極端天氣、消毒不良、飼養(yǎng)不規(guī)范等誘因，極易造成發(fā)病，PED體液免疫效果亟待提升。2014年與2015年免疫效果相比較，2015年母豬和育肥豬群免疫合格率均出現(xiàn)顯著下降，這一方面可能是豬場(chǎng)未能按照正常的免疫程序免疫，免疫積極性下降，另一方面，是現(xiàn)有的疫苗無法對(duì)其起到應(yīng)有的效果。

本實(shí)驗(yàn)分析的樣本均采用了目前本市規(guī)模化豬場(chǎng)普遍采用的免疫形式，即對(duì)待產(chǎn)母豬進(jìn)行兩次免疫，首免在母豬妊娠中期使用滅活苗，二免在母豬妊娠晚期使用弱毒苗的免疫方式，觀察新生仔豬體液免疫消長(zhǎng)規(guī)律，以此來對(duì)疫苗免疫效果進(jìn)行評(píng)估。對(duì)3-26d的窩產(chǎn)仔豬母源抗體進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，結(jié)果顯示母源抗體會(huì)在仔豬在出生后迅速下降，所有仔豬在19天后ELISA抗體均已轉(zhuǎn)陰。PED多侵襲0-9日齡仔豬，在實(shí)驗(yàn)中，67%的窩產(chǎn)仔豬在第9 d 時(shí)抗體轉(zhuǎn)陰，不再受到免疫保護(hù)，這對(duì)于仔豬來說是十分危險(xiǎn)的。

在評(píng)價(jià)細(xì)胞免疫效價(jià)時(shí)，應(yīng)當(dāng)建立檢測(cè)評(píng)價(jià)細(xì)胞免疫的如ELISPOT等方法。IFN-γ是由Th1細(xì)胞亞群分泌的一類細(xì)胞因子，其ELISPOT 檢測(cè)方法可以作為檢測(cè)和評(píng)價(jià)疫苗細(xì)胞免疫的有效方法。為此，我們選定試驗(yàn)?zāi)肛i產(chǎn)前免疫疫苗，對(duì)新生仔豬開展了IFN-γ ELISPOT 方法檢測(cè)，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，仔豬IFN-γ實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)在9-16日齡的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)與對(duì)照組產(chǎn)生了一定差異，但差異不顯著，說明PED疫苗免疫后，新生仔豬在此階段不產(chǎn)生強(qiáng)烈的Th1細(xì)胞免疫反應(yīng)，綜上所述，母豬產(chǎn)前免疫滅活+弱毒進(jìn)行兩次免疫的疫苗注射方式無法產(chǎn)生強(qiáng)力的體液和細(xì)胞反應(yīng)，這應(yīng)與疫苗的毒力效價(jià)不足有關(guān)。

［1］杜曉莉.浙江省豬流行性腹瀉病毒S1基因變異及間接ELISA的建立［D］.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

［2］郭璇.豬流行性腹瀉病毒的分離及間接ELISA的建立［D］.廣西大學(xué)，2013.

［3］衛(wèi)龍興，成建忠.上海規(guī)模化豬場(chǎng)豬病毒性腹瀉的流行病學(xué)調(diào)查［J］.畜禽業(yè)，2010，（259）：60-61.

滬農(nóng)科攻字（2013）第5-5號(hào)；滬農(nóng)科產(chǎn)字（2016）第6號(hào)

王建

李凱航（1977—），男，高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物疫病防治工作。