3種不同腦區定點注射6-OHDA單側損傷大鼠帕金森病模型的比較研究

李　進，孫　杰，趙　楠，吳　鈞，劉　俊，馬　鋼

(云南省昆明市第一人民醫院神經外科，云南 昆明 650011)

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·論著·

3種不同腦區定點注射6-OHDA單側損傷大鼠帕金森病模型的比較研究

李進，孫杰，趙楠，吳鈞，劉俊*，馬鋼

(云南省昆明市第一人民醫院神經外科，云南 昆明 650011)

目的從神經行為學、組織病理和生化方面對3種不同腦區單側定點注射6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)損傷大鼠帕金森病(Parkinson disease，PD)模型進行比較研究。方法健康雄性SD大鼠隨機分為3組(n=10)：紋狀體組、黑質組、黑質+中腦腹側被蓋區組。根據腦立體定位圖譜，將微量6-OHDA單點定位注入大鼠中腦黑質區、紋狀體區和雙點定位注入黑質區與中腦腹側被蓋區。觀察阿樸嗎啡誘發大鼠旋轉行為, 免疫組織化學檢測大鼠黑質區酪氨酸(tyrosinehydroxy-lase，TH+)陽性神經元數目，電化學高效液相色譜法檢測紋狀體中多巴胺(dopamine，DA)及其代謝產物3,4-二羥苯乙酸(dihydroxy-phenyl acetic acid，DOPAC)和高香草酸(homovanillic acid，HVA)含量。結果紋狀體組3周后模型穩定，黑質組與黑質+中腦腹側被蓋區組大鼠2周后穩定， 3組30 min內向健側轉圈數均呈升高趨勢，黑質+中腦腹側被蓋區組高于紋狀體組和黑質組，組間·時點間交互作用差異有統計學意義(P<0.05)。紋狀體組和黑質+中腦腹側被蓋區組造模成功率高于黑質組(P<0.05)。3組大鼠注射6-OHDA損傷側紋狀體中DA、DOPAC、HVA含量和TH+神經元數目均明顯低于非損傷側(P<0.05)。結論紋狀體單點注射6-OHDA損傷建立PD模型成功率高，可作為研究PD的一種穩定可靠的動物模型。

帕金森病；羥基多巴胺類；大鼠

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.06.013

帕金森病(Parkinson disease,PD)是常見于老年人并有向中年移行趨勢的一種神經退行性疾病，其典型的病理特征為中腦黑質多巴胺(dopamine，DA)能神經元缺失以及黑質紋狀體通路中DA數量降低。在PD的研究中，研究者創建和發展了諸多模型，主要有1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1- methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyritine, MPTP) 模型、6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA) 模型、百草枯模型和魚藤酮、模型等[1]。6-OHDA誘發的PD動物模型在神經生化、病理和行為學方面與人類PD具有很大相似性，已被廣泛用于PD的研究。然而，6-OHDA誘導PD神經退行性變性的程度和特點明顯受注射部位的影響[2]。因此，本研究通過3種不同腦區定點注射6-OHDA單側損傷建立大鼠PD模型，從行為學、組織病理和生化方面進行比較，旨在為PD研究提供穩定可靠的動物模型。報告如下。

1　材料與方法

1.1動物來源及分組無特定病原體級雄性SD大鼠，體質量(270±20) g，購于并飼養于昆明醫學院實驗動物中心，室內溫度保持在(23±2) ℃，房間保持12 h晝夜節律，動物自由進食水。實驗中所有操作均遵循美國國立衛生研究院及昆明醫學院實驗動物倫理委員會的規定。健康雄性SD大鼠隨機分為3組(n=10)：紋狀體組、黑質組、黑質+中腦腹側被蓋區組。

1.2實驗儀器和試劑倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS)；高效液相庫侖陣列電化學檢測系統(ESA公司，美國)；Agilent C18反相色譜柱、臺式高速冷凍離心機、冰凍切片機、嚙齒類動物腦立體定位儀(瑞沃德生命科技有限公司)。6-OHDA、阿撲嗎啡均購自Sigma公司；Anti-TH兔抗鼠單克隆抗體、MPTP、GTVisionTM Ⅲ抗鼠/兔通用型免疫組織化學檢測試劑盒購自基因科技(上海)有限公司；多聚甲醛、二甲苯、無水乙醇等購自廣州化學試劑廠。

1.3模型建立手術前饑餓12 h，大鼠稱體質量、編號后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，頭顱水平位固定在腦立體定位儀上，頭頂部去毛，碘液清潔消毒頭部皮膚，沿正中線切開大鼠顱頂皮膚，剝離骨膜，暴露前囟，以前囟為準，依SD大鼠立體定向腦圖譜[2]確定注射坐標。紋狀體組坐標確定：A/P(距前囟中心后)0 mm； L/R(距前囟中心左右)-3 mm；O/V(距腦膜表面深度)：-5.5 mm、-4.5 mm。黑質組坐標確定：A/P -5.2 mm； L/R -1.8 mm；O/V -7.8 mm。黑質+中腦腹側被蓋區組坐標確定：AP -5.2 mm； L/R 1.8 mm；O/V -7.8 mm；A/P -4.6 mm； L/R -0.9 mm；O/V -7.8 mm。

按照上述坐標用10 L微量進樣器向3個實驗組坐標注射6-OHDA(溶于0.1%維生素C中，濃度為4 g/L)。紋狀體組：單點注射2.5 L。黑質組：單點注射4 L。黑質+中腦腹側被蓋組：雙位點注射，每點注射2 L。注射速度為1 L/min。注射完畢后留針10 min，以1 mm/min 速度緩慢旋轉退針，止血，縫合皮膚, 碘酒消毒。術后連續3 d肌內注射青霉素納50萬U預防感染。大鼠清醒后置于籠內正常環境飼養。

1.4行為學轉圈實驗手術后2周腹腔注射阿撲嗎啡(0.5 mg/kg)，在空曠處預觀察10 min，如果大鼠開始向健側轉圈，記錄30 min內的轉圈數，每周1次，連續測量3周，如果30 min 內轉圈數大于210次，則模型視為成功，記錄3種模型大鼠在每周的轉圈次數。

1.5電化學高壓液相系統檢測采用電化學高壓液相系統檢測腦組織中DA、3,4-二羥苯乙酸(dihydroxy-phenyl acetic acid，DOPAC)和高香草酸(Homovanillic acid，HVA)含量[3-4]。每組大鼠按照以上方法造模和給藥，水合氯醛麻醉，斷頭后迅速取出大腦。在冰浴條件下分離取出雙側紋狀體。組織稱質量后每一組織加入 0.1 mol/L高氯酸提取液，冰浴勻漿后12 000 r/min離心15 min，取上清備用。采用Agilent C18反相色譜柱(150 mm×3 mm，4.6 μm), 流動相為甲醇/水=10∶90，水相中每升含有0.05 mol/L NaH2PO47.8 g，0.027 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)8 mg，0.74 mmol/L辛烷磺酸鈉，2 mmol/L氯化鉀，流量1 mL/min，柱溫33 ℃，檢測電壓0.52 V，流動相pH調節為3.5，精確吸取20 μL注入色譜儀分析，以各標準品的濃度為橫坐標(X)、各組分的峰面積為縱坐標(Y)進行回歸分析，得到標準曲線。

1.6免疫組織化學檢測檢測腦黑質致密部中酪氨酸陽性(tyrosinehydroxy-lase，TH+)神經元數目。實驗結束時，用10%水合氯醛麻醉動物，灌流、固定。從左心室進針，右心耳剪“V”形切口，先灌注血管沖洗液(磷酸鹽緩沖液 1 000 mL，1 % NaNO22 mL，肝素0.02 g和NaCl 9 g)沖洗至流出的液體為無色，換冰冷的4%多聚甲醛(溶解于0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液)繼續灌流固定。取出預固定的全腦組織，按照質量/體積比(10∶1)置于4%多聚甲醛溶液中4 ℃后固定過夜。然后經磷酸鹽緩沖液洗凈后，逐步放入10%、20%、30%的梯度sucrose溶液中，待組織完全沉底后，將包埋劑包埋的腦組織進行冰凍切片(黑質區取前囟后3.3～5.3 mm區域)，厚度25 μm，整個黑質可切片80張左右。0.05 mol/L檸檬酸緩沖液(pH=6.0)微波抗原修復，高火5 min，中低火10 min，自然冷卻后，3% H2O2避光反應 10 min去除內源性的過氧化物酶, 1%TritonX-100通透切片 30 min，10% 馬血清封閉 1 h，TH+一抗4 ℃孵育過夜；辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h；DAB工作液顯色，自來水終止顯色反應。70%、80%、90%、100% 梯度酒精依次脫水，每次3 min；二甲苯透明2次，每次5 min。最后用中性樹脂封片。倒置顯微鏡下計算小鼠TH+神經元的數目。每只大鼠從前往后選10張位置對應的切片用體視學網格計數黑質致密部TH+神經元數目，作為評價指標。

1.7統計學方法應用SPSS 19.0 統計軟件包進行數據分析。計量資料比較分別采用單因素方差分析、q檢驗、配對t檢驗及重復測量設計資料的方差分析；計數資料比較采用χ2檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2　結　　果

2.13組大鼠轉圈比較紋狀體組大鼠手術2周后轉圈行為不明顯，大鼠轉圈時間< 30min或者轉圈時容易停頓很久，但是3周后模型基本穩定，轉圈很穩定。黑質+中腦腹側被蓋區組和黑質組大鼠模型2周后已經穩定。3組30 min內向健側轉圈數均呈升高趨勢，黑質+中腦腹側被蓋區組高于紋狀體組和黑質組，組間、時點間差異無統計學意義(P>0.05)，組間·時點間交互作用差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

4周時紋狀體組大鼠造模成功率為100.0%，黑質+中腦腹側被蓋區組為60.0%，黑質組為30.0%，紋狀體組和黑質+中腦腹側被蓋區組造模成功率高于黑質組，差異有統計學意義(χ2=10.622，P=0.005)。

表13組大鼠手術2～4周30 min內向健側轉圈數比較

組別 轉圈數2周3周4周紋狀體組237.6±156.6351.8±157.5360.8±99.1黑質組334.3±17.8349.0±50.9359.5±38.9黑質+中腦腹側被蓋區組390.3±50.2392.0±31.2423.7±103.5組間F=0.950 P=0.413時點間F=1.450 P=0.253組間·時點間F=3.370 P=0.006

2.23組大鼠紋狀體中DA、DOPAC、HVA含量和TH+神經元數目比較3組大鼠注射6-OHDA損傷側紋狀體中DA、DOPAC、HVA含量和TH+神經元數目均明顯低于非損傷側(P<0.05)。3組間非損傷側和損傷側DA含量和TH+神經元數目比較差異均無統計學意義(P>0.05)；黑質組非損傷側DOPAC含量高于紋狀體組和黑質+中腦腹側被蓋區組，黑質組和黑質+中腦腹側被蓋區組損傷側DOPAC含量高于紋狀體組，黑質組和黑質+中腦腹側被蓋區組非損傷側HVA含量高于紋狀體組，黑質組損傷側HVA含量高于紋狀體組和黑質+中腦腹側被蓋區組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表23組DA、DOPAC、HVA、TH+神經元數目比較

組別 DA(ng/mg)非損傷側損傷側DOPAC(ng/mg)非損傷側損傷側HVA(ng/mg)非損傷側損傷側TH+神經元數目(個/切片)非損傷側損傷側紋狀體組16.8±7.40.5±0.1*3.1±0.70.2±0.1*1.6±0.50.1±0.1*152±1018±10*黑質組22.3±5.60.6±0.2*5.8±0.7#0.4±0.1*#2.1±0.3#0.4±0.1*#162±2713±4* 黑質+中腦腹側被蓋區組17.9±7.20.6±0.8*3.6±0.2△0.3±0.1*#2.1±0.1#0.1±0.0*△153±619±10* F1.8420.14560.68610.0007.14330.0001.0521.435 P0.1780.8660.0000.0000.0030.0000.3630.256

*P<0.05與非損傷側比較(配對t檢驗)#P<0.05與紋狀體組比較△P<0.05與黑質組比較(q檢驗)

3　討　　論

PD為繼阿爾茨海默病后第2個常見的神經退行性疾病，65歲以上的人群發病率為1%～2%[5]。這種疾病的特點是黑質致密部的多巴胺能神經元損毀50%～70%，即紋狀體DA嚴重缺失[6]。開展動物模型研究可以更好地了解PD的病因、發病機制、分子機制和潛在的治療策略。

PD動物模型最相關的包括：選擇性地破壞兒茶酚胺系統的神經毒性化學作用劑如6-OHDA、1-甲基-1,2,3,6-四氫呋喃、魚藤酮和百草枯(農藥殺蟲劑)、炎癥調節劑、泛素-蛋白酶體系統抑制劑等模型；幾個基因操控模型如α突觸核蛋白、DJ-1、PINK1 (PTEN induced putative kinase 1)、Parkin、富含亮氨酸報告激酶2轉基因或基因敲除動物[7]。到目前為止，應用神經毒素選擇性破壞兒茶酚胺系統引起動物DA能神經元損毀是研究PD的動物模型復制使用最廣泛的方法。

6-OHDA是一種DA羥基化類似物。Tranzer 等[8]發現6-OHDA能夠選擇性誘導交感腎上腺素能神經未梢變性，由此引導出“化學去神經”的神經生物學新概念。目前，這種神經毒性分子在神經生物學中被廣泛用于損毀黑質紋狀體DA系統，作為PD模型復制最常用的一種工具[1]。6-OHDA在大腦中能誘導DA能和去甲腎上腺素能神經元變性[9]。因為6-OHDA在結構上與DA和去甲腎上腺素類似，在質膜上的轉運體、DA轉運體和去甲腎上腺素轉運體都對6-OHDA具有高度親和力[10]。一旦進入神經元內，6-OHDA積聚在胞漿被快速氧化產成活性氧，最終引起氧化應激相關的細胞毒性[11-12]。因此，這2種神經元特別容易受到損毀。在使用6-OHDA之前給予選擇性去甲腎上腺素再攝取抑制劑(去甲丙咪嗪或丙咪嗪)，阻止這些動物發生去甲腎上腺素能神經元損傷[ 10]。本研究結果顯示，電化學高效液相色譜法檢測紋狀體中DA及其代謝產物DOPAC和HVA含量顯著減少。

單側注射6-OHDA后能引起明顯的黑質紋狀體通路的順行性變性[11-12]。這個變性首先開始在黑質TH+神經元，隨后TH+紋狀體的DA能接頭損失，以及相關的DA耗竭[12]。紋狀體退行性變性時顯示TH+紋狀體末梢死亡先于黑質TH+神經元，表明復制了人類PD的病理過程[12]。一些證據表明在PD的初始病理部位始于紋狀體，“未梢死亡”的軸突病變導致黑質退行性病變和神經細胞損失[13]。6-OHDA模型可導致DA耗竭、黑質DA神經元損失和行為缺陷[14]。本研究結果顯示，免疫組織化學檢測大鼠損傷側黑質區TH+神經元數目顯著減少，表明DA神經元死亡增加，其數目嚴重缺失。

6-OHDA不能通過血腦屏障，通常需要通過立體定向頭架定點直接局部注射到黑質致密區或內側前腦束，這區域由黑質神經細胞體到紋狀體或紋狀體的傳出纖維構成，在那里6-OHDA特異性地殺死DA 和去甲腎上腺素神經元[11]。通常在6-OHDA損毀神經元幾周后，大鼠出現自發性旋轉[10，15]，繼這種單側毀損后，全身注射DA受體激動劑(阿樸嗎啡)、3,4-二羥基苯丙氨酸(左旋多巴，DA的前體)或DA釋放化合物(苯丙胺)誘導發生不對稱旋轉。黑質紋狀體病變的大小與旋轉運動的行為有關[16]。因此，動物出現自發性旋轉是評價PD動物模型成功建立的一項重要指標。

6-OHDA 誘導神經退行性變性的程度和特點顯著受到注射部位的影響[4]，最常在單側被注射到黑質、內側前腦束或紋狀體3個區域。一般神經末梢對6-OHDA毒性比軸突和細胞體更敏感[17]，當注射到黑質或前腦內側束時，6-OHDA在黑質紋狀體通路產生完整且快速的損傷病變。當6-OHDA被注射到黑質，DA神經元變性發生在12 h內，而紋狀體的末梢明顯損失出現在2～3 d后[18]。6-OHDA注射到內側前腦束時，6-OHDA誘導紋狀體末梢變性，先于DA細胞發生死亡前[19]。與黑質和內側前腦束相比，6-OHDA到達紋狀體時誘導緩慢、漸進和部分的黑質紋狀體結構損傷，持續3周時間[20]。本研究結果顯示，紋狀體單點注射大鼠3周后出現穩定轉圈且造模成功率高，黑質單位點注射及黑質與中腦腹側被蓋區雙位點注射大鼠2周后出現穩定轉圈，但造模成功率低。表明6-OHDA紋狀體單點注射大鼠模型建立成功率高，可作為建立PD動物模型穩定可靠的方法。

綜上所述，6-OHDA紋狀體單點注射方法主要優點：①進展性和廣泛損失病變與PD有關；②這種方案可以產生PD的運動神經癥狀；③立體定向注射到紋狀體，增加PD模型成功的可能性；④對動物量化異常轉圈運動具有獨特效果；⑤單側注射損傷一個大腦半球，剩下另一未有損傷病變的大腦半球可作為內部對照。因此，6-OHDA注射單側損傷大鼠PD模型廣泛用于臨床前抗PD作用、新的藥物治療神經保護作用以及臨床改善細胞移植作用的評估研究。

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(本文編輯：趙麗潔)

Comparative study of Parkinson disease rat model via unilateral injection of6-OHDA into three different brain regions

LI Jin, SUN Jie, ZHAO Nan, WU Jun, LIU Jun*, MA Gang

(Department of Neurosurgery, the First People's Hospital of Kunming City，Yunnan Province, Kunming 650011, China)

ObjectiveTo compare Parkinson disease(PD) rat models via unilateral injection of 6-hydroxydopamine(6-OHDA) into three different brain regions from the aspects of neurobehavior, histopathology and biochemistry. MethodsHealthy male SD rats were randomly divided into three groups(n=10):striatum group， substantia nigra group，substantia nigra+ midbrain ventral tegmental area group. According to the stereotaxic atlas of the brain, the trace 6-OHDA unilateral injection into rat substantia nigra and striatum were performed via single point position in striatum group and in substantia nigra group, and 6-OHDA injection into rat substantia nigra and midbrain ventral tegmental area were performed by double point position in substantia nigra+midbrain ventral tegmental area group.The rotation behavior induced by apomorphine was observed in rats. The tyrosine positive neurons in the rat substantia nigra were detected by immunohistochemistry. The dopamine(DA) and its metabolic products 3, 4 dihydroxy phenyl acetic acid(DOPAC) and homovanillic acid(HVA) were measured by electrochemical high-performance liquid phase chromatography in rat striatum. ResultsIn the rats with unilateral injection 6-OHDA into striatum viasingle point position, stablerotation appeared at 3 weeks, and a high rate of success in animal model was obtained. In the rats with substantia nigra injection model viasingle point and in the rats with substantia nigra + midbrain ventral tegmental area via double point position injection model, stable rotation appeared after 2 weeks, but animal model success rate is low. Three types of PD rat models in different brain regions injected by 6-OHDA showed that the number of tyrosinehydroxy-lase neurons in substantia nigra area was severely deficient, and that the contents of DA and its metabolites(DOPAC, HVA) in striatum were significantly decreased. ConclusionRat model with unilateral injection 6-OHDA into striatum via single point position is highly successful, which can be used as a stable and reliable animal model for the study on PD.

Parkinson disease; hydroxydopamines; rats

2016-01-25；

2016-02-15

云南省教育廳科學研究基金(2013C227)

李進(1978-)，男，湖北黃岡人，云南省昆明市第一人民醫院主治醫師，醫學碩士，從事神經外科疾病診治研究。

。E-mail：15877991837@163.com

R7742.5

A

1007-3205(2016)06-0667-05