甲潑尼龍對鹽酸誘導急性肺損傷大鼠的保護作用

甄　潔，陳　煒*，朱　曦，邊偉帥，趙　磊，盛　博

(1.首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院重癥醫學科,北京 100038；2.北京大學第三醫院危重癥醫學科,北京 100191)

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·論著·

甲潑尼龍對鹽酸誘導急性肺損傷大鼠的保護作用

甄潔1，陳煒1*，朱曦2，邊偉帥1，趙磊1，盛博1

(1.首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院重癥醫學科,北京 100038；2.北京大學第三醫院危重癥醫學科,北京 100191)

目的探討不同劑量甲潑尼龍對鹽酸誘導急性肺損傷(acute lung injury，ALI)大鼠的保護作用。方法按隨機數字表法將48只健康雄性SD大鼠分為模型組、對照組、小劑量甲潑尼龍干預組和大劑量甲潑尼龍干預組4組，每組12只。模型組經氣管滴注鹽酸(pH=1.8，2 mL/kg)，對照組給予等量生理鹽水，小劑量甲潑尼龍干預組和大劑量甲潑尼龍干預組在制模后分別按5 mg/kg及40 mg/kg劑量腹腔注射甲潑尼龍。制模后4 h，光鏡下觀察肺組織病理改變，計算肺濕/干質量(W/D)比值，測定支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveloar lavage fluid,BALF)中蛋白含量、中性粒細胞比例(polymorphonuclear neutrophils, PMN%)及肺組織中Na+-K+-ATP酶α1亞基mRNA的相對含量。結果對照組肺組織結構清楚，肺泡間隔均勻，肺泡內無纖維蛋白滲出和中性粒細胞浸潤。模型組可見支氣管上皮細胞脫落、肺泡腔內大量纖維蛋白滲出及水腫液生成。小劑量甲潑尼龍干預組和大劑量甲潑尼龍干預組較模型組肺組織病理變化有不同程度改善。模型組、小劑量甲潑尼龍干預組、大劑量甲潑尼龍干預組W/D值、BALF中蛋白含量、PMN%均高于對照組，Na+-K+-ATP酶α1亞基mRNA水平低于對照組，小劑量甲潑尼龍干預組、大劑量甲潑尼龍干預組BALF中蛋白含量低于模型組，差異有統計學意義(P<0.01)。結論甲潑尼龍可以明顯改善鹽酸誘導ALI大鼠的肺損傷程度，但小劑量甲潑尼龍較大劑量甲潑尼龍對肺保護作用更顯優勢。

急性肺損傷；甲潑尼龍；鹽酸；大鼠

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.06.008

吸入性肺炎，即誤吸入酸性物質、食物、胃內容物以及其他刺激性液體和揮發性物質后，引起的化學性肺炎。常見于顱腦外傷、腦血管事件、酒精或藥物等各種原因導致的意識狀態改變的重癥監護病房(intensive care unit，ICU)患者，嚴重者可發生呼吸衰竭、急性肺損傷(acute lung injury，ALI)、呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)，甚至危及患者生命。研究顯示，ARDS的病死率為10%～90%，其中吸入性肺炎相關的ALI、ARDS的病死率為30%[1-2]。 甲潑尼龍是一種中效糖皮質激素，具有強大的抗炎、抑制炎癥因子釋放及穩定細胞膜的作用。本研究通過建立鹽酸誘導的ALI大鼠模型，探討不同劑量甲潑尼龍在吸入性肺炎引起的ALI、ARDS治療中的應用價值。報告如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物健康雄性SD大鼠48只，體質量200～250 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證號SCXK(京)2012-0001。按隨機數字表法分為4組：模型組、對照組、小劑量甲潑尼龍干預組和大劑量甲潑尼龍干預組，每組12只。

1.2主要藥物和試劑鹽酸(石家莊市試劑廠)；Trizgol試劑、通用引物、4種脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleotide triphosphate，dNTP)、核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA)酶抑制劑、脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)聚合酶混合物、100 bp DNA分子梯度(天根生化科技有限公司)；逆轉錄酶(Promega公司)；特異性引物(北京賽百勝基因技術公司)。

1.3動物模型制備與處理模型組大鼠稱質量后腹腔注射10%水合氯醛(4 mL/kg)麻醉，仰臥位固定，備皮、消毒后切開頸前正中皮膚，暴露氣管，使大鼠呈頭高腳低位，用7號針頭刺入氣管，緩慢滴注鹽酸(pH=1.8，2 mL/kg)。注藥完畢后，保持體位約2 min，縫合切口。對照組按同樣方法給予等量生理鹽水。小劑量甲潑尼龍干預組及大劑量甲潑尼龍干預組在模型制備后分別腹腔內注射小劑量甲潑尼龍(5 mg/kg)及大劑量甲潑尼龍(40 mg/kg)。

本研究實驗動物處置方法符合動物倫理學標準。

1.4檢測指標及方法

1.4.1標本收集所有大鼠給藥4 h后，腹腔注射10%水合氯醛(4 mL/kg)麻醉，開胸，心臟穿刺取血處死。游離右肺組織完整切除，取部分肺組織留檢。游離主氣管，做倒“T”字型切口，右主支氣管結扎，行氣管插管并固定后用4 ℃無菌生理鹽水進行肺葉灌洗，回收全部灌洗液，離心(1 200 r/min，10 min)，上清液用于蛋白測定，細胞沉淀用于計算中性粒細胞比例。

1.4.2肺病理組織學觀察部分肺組織用10%福爾馬林溶液固定48 h后，常規進行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色。光鏡觀察肺組織病理學改變。

1.4.3肺濕/干質量比(W/D)測定取部分肺組織先測定濕質量后，放置烤箱(80 ℃)48 h，取出稱干質量，計算W/D。

1.4.4支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中蛋白含量測定采用考馬斯亮蘭法測定BALF中蛋白含量。設置空白管、標準管和測定管，加入試劑后混勻，靜置10 min，在紫外分光光度計(波長=595 nm，光徑=1 cm)內調零空白管，測定各管吸光度值。計算公式如下：蛋白含量(g/L)=測定管吸光度/標準管吸光度×標準管濃度(g/L)。

1.4.5BALF中中性粒細胞比例(polymorphonuclear leukocyte,PMN%)BALF中的細胞沉淀懸浮于200 μL生理鹽水中，取部分涂片，HE染色后，光鏡下根據細胞形態計數200個細胞，計數中性粒細胞所占的比例。

1.4.6逆轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)測定肺組織中Na+-K+-ATP酶α1亞基mRNA的相對含量。取部分肺組織，用4 ℃生理鹽水洗凈血液，濾紙吸干水分后稱質量，提取總RNA，合成cDNA，PCR擴增，進行Na+-K+-ATP酶α1亞基mRNA的相對含量測定。引物序列：α1上游引物5′- TCTGCGTCG-TGGTTCTTA-3′；α1下游引物5′- CTTGGGCTG-CGATTGGAT-3′；β-actin上游引物5′-CGTCGAC-ATGCGTAAAGAC -3′；β-actin下游引物5′-TTGAAGCTGGACTGTGAG -3′。β-actin為內對照，擴增片段長度201 bp，α1亞基擴增片段長度129 bp。反應條件：94 ℃預變性5 min,95 ℃變性45 s,51 ℃退火45 s,72 ℃延伸45 s，共35個循環，最后72 ℃延伸7 min。

1.5統計學方法應用SPSS 17.0 統計學軟件分析數據，計量資料比較分別采用單因素方差分析和q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2　結　　果

2.1肺組織病理形態學特點對照組肺組織結構清楚，肺泡間隔均勻，肺泡內無纖維蛋白滲出和中性粒細胞浸潤；模型組可見支氣管上皮細胞脫落、肺泡腔內大量纖維蛋白滲出及水腫液生成；小劑量甲潑尼龍干預組和大劑量甲潑尼龍干預組較模型組肺組織病理變化有不同程度改善。見圖1。

2.2各組觀察指標比較模型組、小劑量甲潑尼龍干預組、大劑量甲潑尼龍干預組W/D值、BALF中蛋白含量、PMN%均高于對照組(P<0.01)，Na+-K+-ATP酶α1亞基mRNA水平低于對照組(P<0.01)。小劑量甲潑尼龍干預組、大劑量甲潑尼龍干預組BALF中蛋白含量低于模型組(P<0.01)，小劑量甲潑尼龍干預組、大劑量甲潑尼龍干預組間BALF中蛋白含量差異無統計學意義(P>0.05)。模型組、小劑量甲潑尼龍干預組、大劑量甲潑尼龍干預組間W/D值、PMN%、Na+-K+-ATP酶α1亞基mRNA差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表14組肺組織W/D值、BALF中蛋白含量、PMN%和Na+-K+-ATP 酶α1亞基mRMA比較

組別 W/D值BALF中蛋白含量(g/L)PMN%Na+-K+-ATP酶α1-mRMA對照組 4.32±0.540.24±0.076.25±0.240.604±0.05模型組 5.12±0.15*0.99±0.37*20.20±5.18*0.306±0.03*小劑量甲潑尼龍干預組5.04±0.25*0.58±0.21*#19.00±7.17*0.554±0.10*大劑量甲潑尼龍干預組5.00±0.11*0.70±0.11*#17.75±4.89*0.539±0.09*F 16.91023.36019.50539.358P 0.0010.0000.0000.000

*P<0.01與對照組比較#P<0.01與模型組比較(q檢驗)

3　討　　論

ICU收治的ARDS患者中，誤吸引起的吸入性肺炎是常見原因之一[3]，其病死率高達40%～60%。吸入性肺炎引起ALI的機制可以分為2個階段：第一階段是酸性物質對肺泡及毛細血管膜造成直接損傷，由于吸入物質分布不均，這種損傷通常有局限性；第二階段肺組織釋放以腫瘤壞死因子α為代表的多種炎性介質，引起中性粒細胞(又稱為趨化多核粒細胞)聚集、激活，誘發炎癥反應，形成肺泡上皮細胞和肺血管內皮細胞損傷[4]。吸入性肺炎所致ALI主要病理生理特點是局部肺組織壞死、肺泡結構損壞、肺毛細血管通透性增加、血清蛋白從肺泡毛細血管漏出肺泡腔及單核巨噬細胞、中性粒細胞等炎癥細胞聚集[5]。吸入物質的分布越廣，損害程度越重。是目前危重癥醫學領域的治療難點之一。

本研究通過氣管內滴入鹽酸模擬吸入性肺炎導致的 ALI,模型組BALF中的蛋白含量和肺組織W/D比值均明顯升高，提示鹽酸直接損害肺泡上皮細胞和肺血管內皮細胞，使其壞死脫落，肺泡毛細血管膜通透性升高，纖維蛋白滲漏至肺泡腔，大量水腫液生成，形成肺水腫。

中性粒細胞等炎癥細胞的激活、聚集被認為是ALI中最重要的作用機制之一。中性粒細胞的積累、凋亡的延遲促使肺組織中多種炎性細胞因子呈“瀑布式”釋放，引起腫瘤壞死因子α等炎癥因子明顯升高，使抗炎因子與炎性因子失衡，從而形成急性炎癥損傷[6-7]。本研究中模型組PMN%明顯升高，提示吸入性肺炎引起的ALI亦通過激活中性粒細胞造成嚴重的繼發性損傷。這與陸戰超等[8]的研究結果是一致的。

Na+-K+-ATP酶又稱為鈉泵,由α1、α2、β1亞基組成,在肺組織中主要分布于肺泡細胞膜上，在肺泡上皮液體的主動轉運過程中起重要作用。本研究模型組肺組織中的 Na+-K+-ATP酶α1亞基表達水平顯著低于對照組，可以推測 Na+-K+-ATP 酶基因表達水平下調、酶活性降低導致ALI肺組織處理鈉水能力下降，從而影響肺水的吸收。

吸入性肺炎所致ALI發病機制復雜，損傷范圍不均一，病變進展迅速，目前臨床中常規治療方法對ALI、ARDS預后改善尚無肯定的價值。糖皮質激素在ALI、ARDS的治療中已有數十年的歷史，但長期以來，國內外學者對糖皮質激素在ALI、ARDS中的應用時機、劑量、療程及效果意見尚不統一。目前有研究表明，糖皮質激素不能控制ARDS病情進展[9]。有研究則認為ARDS晚期應用小劑量、長療程的糖皮質激素能夠改善預后、降低病死率[10-11]。本研究以甲潑尼龍作為糖皮質激素的代表，探討其在吸入性肺炎引起的ALI、ARDS中的肺保護作用。

本研究結果顯示，給予小劑量甲潑尼龍(5 mg/kg)干預后，與模型組比較，BALF中蛋白含量明顯降低。其機制可能是：甲潑尼龍可以直接改善肺組織血管通透性，抑制血管內皮細胞凋亡，減少纖維蛋白漏入組織間隙。

甲潑尼龍干預后，另一有顯著改善的指標是Na+-K+-ATP 酶α1亞基mRNA的表達水平。丁新民等[12]研究證明地塞米松抑制Na+-K+-ATP 酶活性的下降。本研究結果與其一致。由此可以推測，Na+-K+-ATP 酶α1亞基mRNA的表達增加可能是酶水解活性增加的原因之一，Na+-K+-ATP 酶活性增加可調節肺水的吸收。經激素干預后，雖然Na+-K+-ATP 酶α1亞基mRNA表達水平有所升高，但是本研究中激素干預組仍有部分大鼠組織病理學無明顯改善，光鏡下仍可見肺泡腔內大量含有纖維蛋白的水腫液，這提示肺水腫液的生成和調節除了 Na+-K+-ATP酶參與外，還有其他途徑，如水通道蛋白參與了肺水的轉運[13]，其具體機制有待進一步研究。

本研究甲潑尼龍干預后，2個甲潑尼龍干預組BALF中PMN%與模型組比較差異無統計學意義。分析其原因可能是：①鹽酸吸入誘導的ALI損傷過程分為直接性損傷及繼發性損傷2個時相，甲潑尼龍干預時間早晚可能對PMN的抑制作用有直接影響；②糖皮質激素通過與糖皮質激素受體結合起到抗炎作用，ALI時糖皮質激素受體結合能力下降[14]；③Shi等[15]研究發現糖皮質激素能促進炎癥介質釋放，因此提示激素在不同情況下對炎癥反應的影響并不一致，但其機制尚不明確。

本研究應用2種不同劑量甲潑尼龍進行干預，小劑量甲潑尼龍在改善鹽酸吸入所致ALI蛋白滲出、肺水形成等方面作用顯著，但是大劑量甲潑尼龍對各項指標改善均差異無統計學意義，提示小劑量甲潑尼龍對ALI有保護作用。有研究證實小劑量糖皮質激素能顯著抑制ARDS時的炎癥反應，提高生存率[16]。

鹽酸吸入誘導的大鼠ALI模型雖然在一定程度上模擬了吸入性肺炎引起的ALI，但與臨床情況仍存在一定差別。胃內容物包括鹽酸、蛋白酶等多種物質，吸入物的成分、數量和性質不同，對肺組織造成的損傷程度也不盡相同。甲潑尼龍可以減輕鹽酸吸入所致ALI的肺毛細血管損傷、減輕肺水腫的形成，表明其對吸入性肺炎所致的ALI、ARDS存在一定的臨床應用價值，但由于本研究中甲潑尼龍的具體劑量、作用時相及實驗模型的選擇局限性，其在ALI中的具體作用機制還需深入探討。(本文圖見封三)

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(本文編輯：趙麗潔)

The protective effects of Methylprednisolone on rats with HCl-induced acute lung injury

ZHEN Jie1, CHEN Wei1*, ZHU Xi2, BIAN Wei-shuai1, ZHAO Lei1, SHENG Bo1

(1.Department of Intensive Care Unit, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, Beijing100038, China; 2.Department of Intensive Care Vnit, the Third Hospital ofPeking University, Beijing 100191, China)

ObjectiveTo investigate the protective effects of different doses of methylprednisolone(MP) on HCL-induced acute lung injury in rats. MethodsA total of 48 male SD rats were divided randomly into four groups according to the random number table method:model group, control group, small-dose MP group and high-dose MP group. Each group included 12 rats. The model group were injected with hydrochloric acid(pH=1.8, 2 mL/kg) by the endotracheal intubation, and the control group were injected with equal volume of normal saline by the endotracheal intubation. The small-dose MP group and high-dose MP group were intraperitoneally injected with 5 mg/kg and 40 mg/kg MP after duplicating model. Four hours after duplicating model, the pathological changes of lung tissue were observed under light microscope. The lung wet/dry ratio(W/D) was calculated. Protein concentration, PMN% in bronchoalveloar lavage fluid and the expression of Na+-K+-ATPase α1isoforms mRNA in lung tissues were measured. ResultsIn the control group, the lung tissue structure was clear, the alveolar septum was uniform, and there was no fibrin exudation and neutrophil infiltration in the alveolar. Model group showed the bronchial epithelial cells, alveolar cavity, a large number of fibrin exudation and edema fluid formation. Compared with model group, there were different degrees of improvement of the lung tissue pathologic characteristics in the small-dose MP group and high-dose MP group. In model group，small-dose MP group and high-dose MP group, W/D，protein concentration and PMN% in BALF were significantly increased， the Na+-K+-ATPase α1isoforms mRNA expressions were significantly lower. and the protein concentrations in BALF in small-dose MP group and high-dose MP group were significantly decreased, compared with control group. The difference was statistically significant (P<0.01). ConclusionMP can significantly improve lung injury degree of hydrochloric acid-induced acute lung injure model of rats. Small-dose MP has more advantage on lung protection than high-dose MP on acute lung injury of rats.

acute lung injury； methylprednisolone； hydrochloric acid； rats

2016-04-18；

2016-05-20

國家自然科學基金(81372043)；首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院青年博士基金課題項目(2012-QB14)

甄潔(1981-)，女，河北淶水人，首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院住院醫師，醫學碩士，從事危重癥診治研究。

。E-mail:hanwa@aliyun.com

R563.9

A

1007-3205(2016)06-0647-06