香菇中多糖含量測定方法的比較研究

周勇，易延逵，楊曉敏，李亞平（.無限極（中國）有限公司，廣東廣州50665；.南方醫科大學，廣東廣州5055）

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香菇中多糖含量測定方法的比較研究

周勇1，易延逵2，*，楊曉敏2，李亞平2
（1.無限極（中國）有限公司，廣東廣州510665；2.南方醫科大學，廣東廣州510515）

采用苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法測定香菇中多糖含量，考察二種方法的線性關系，重復性，精密度，穩定性、準確度。香菇中多糖采用苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法測定結果接近，二種方法的線性關系、重復性、精密度、穩定性均較好，回收率平均值均在95%～105%之間。本試驗為香菇中多糖含量測定方法的選擇提供了試驗依據。

香菇；多糖；含量測定；苯酚-硫酸法；蒽酮-硫酸法

香菇為真菌類擔子菌綱傘菌目傘菌科香蕈［Lentinus edodes（Berk.）Sing］，的干燥子實體。性甘，平。功能益氣不饑，治風破血，化痰理氣，益味助食，經常食用可以預防人體因缺乏VD引起的血磷和血鈣代謝的障礙后所患的佝僂病，預防人體各種粘膜及皮膚的炎癥，預防身體衰弱、毛細血管破裂，牙床以及腹腔出血等。香菇主要含VD原（麥角甾醇）、VB（2核黃素）、V（C抗壞血酸）、腺嘌呤香茹精等等；孢子還含甘露醇、海藻糖（trehalose）［1-2］。

香菇多糖是香菇中重要的活性成分，香菇多糖近年來發現具有（β～1，3葡聚糖）增強細胞免疫能力，從而抑制癌細胞的生長，抗病毒，抗肝炎作用［3］。中華人民共和國農業行業標準NY/T1676-2008《食用菌中粗多糖含量的測定》關于食用菌粗多糖含量的測定中采用苯酚硫酸法建立多糖的含量測定方法，為此我們采用苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法測定香菇中多糖含量，對結果進行比較研究。

1　材料

1.1原料與試劑

香菇購自廣州市藥材公司，經南方醫科大學中藥鑒定教研室鑒定為傘菌科香蕈Lentinus edodes（Berk.）Sing的干燥子實體。

葡萄糖（批號：130529，由廣州市齊云生物科技有限公司提供）；水為重蒸水；其它試劑均為分析純。

1.2儀器設備

UV-2401可見紫外分光光度儀：日本島津；電子天平（0.01 g）：上海佑科；BS－llOS電子天平（0.001 g）：德國Sartorius公司；XY-600B多功能粉碎機：永康市小寶電器有限公司；KH-100DE型數控超聲儀：昆山禾創超聲儀器有限公司；KH-100DE型數控超聲波清洗器：昆山禾創超聲儀器有限公司；TDL-40B離心機：飛鴿牌。

2　方法與結果

2.1苯酚-硫酸法測定香菇中多糖含量［4-5］

2.1.1標準曲線的制備

萄糖對照品溶液的配制：取已干燥的無水葡萄糖10 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加水適量溶解，加水至刻度，搖勻，即得（每1 mL中含無水葡萄糖0.1 mg）。

標準曲線的繪制：精密量取對照品溶液0.0、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、1.5 mL，分別置具塞試管中，分別加水補至2.0 mL，分別加5%的苯酚溶液1 mL，混勻，迅速加入濃硫酸5 mL，混勻，溫水中恒溫（50℃）反應15 min，再于冰水中冷卻，終止其反應；以第一份為空白，照分光光度法（中國藥典附錄ⅤB），在485 nm處測定吸光度。以葡萄糖的濃度C為縱坐標，以吸光度A為橫坐標進行回歸處理，結果求得回歸方程y=6.371 5x+ 0.012 7（濃度單位mg/2 mL），R2=0.998 9。結果見表1、圖1、圖2。

表1　線性關系考查結果Table 1　Results of linear correlation review

圖1　葡萄糖標準曲線紫外掃描色譜圖Fig.1　Amylaceum standard curve UV chromatogram

圖2　葡萄糖標準曲線圖Fig.2　Amylaceum standard curve diagram

2.1.2供試品溶液的制備及樣品測定［6］

取香菇粗粉約0.03 g，精密稱定，加水5 mL浸潤樣品，緩慢加入20 mL 95%乙醇，搖勻，超聲提取（1 000 Hz）30 min，濾過，用少量乙醇洗滌濾器，濾渣連同濾紙置燒瓶中，加水50 mL，加熱回流2 h，趁熱濾過，用少量熱水洗滌濾器，合并濾液與洗液，放冷，移至100 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。精密量取供試品溶液2.0 mL，置具塞依法測定吸光度A，根據標準曲線計算出供試品溶液中多糖含量，計算，即得。結果見表1、圖1。

2.1.3提取方法的優化

目前香菇多糖測定供試品溶液提取方法主要是提取方法的選擇，為此對提取方法進行了比較研究［7-8］。

水提醇沉法：取香菇粗粉約0.1 g，精密稱定，加水50 mL，加熱回流2 h，趁熱濾過，用少量熱水洗滌濾器，合并濾液與洗液，放冷，移至100 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，精密量取上述樣品液2mL，加乙醇10mL，攪拌，在5 000 r/min離心10 min，取沉淀加水溶解，置100 mL量瓶中，并稀釋至刻度，即得供試品溶液。

醇提后水提法：取香菇粗粉約0.5 g，精密稱定，加水5 mL浸潤樣品，緩慢加入20 mL 95%乙醇，搖勻，超聲提取（1 000 Hz）30 min，濾過，用少量乙醇洗滌濾器，濾渣連同濾紙置燒瓶中，加水50 mL，加熱回流2 h，趁熱濾過，用少量熱水洗滌濾器，合并濾液與洗液，放冷，移至100 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

取供試品溶液2 mL，加入5%苯酚水溶液1 mL，混勻，再迅速加濃硫酸5 mL，立刻混勻，溫水中恒溫（50℃）反應15 min，再于冰水中冷卻，終止其反應；以空白調零，于485 nm波長處測定［8］。進行3次平行實驗，分別計算多糖含量。結果見表2，圖3。

結果表明水提醇沉法結果偏高。

2.1.4檢測波長的確定

以空白為對照，對葡萄糖對照品溶液和供試品溶液在400 nm～600 nm波長范圍進行掃描測定。

結果表明葡萄糖對照品溶液和供試品溶液在485 nm左右有最大吸收，故確定485 nm為香菇多糖的測定波長。

表2　提取方法優化試驗結果（n=3）Table 2　Results of extracting method optimizing experiment（n=3）

圖3　提取方法優化紫外色譜圖Fig.3　UV diagram of extracting method optimizing experiment

2.1.5重復性試驗

按照供試品制備的方法同時制備6份供試品溶液，依法顯色后分別測定其吸光度A，計算香菇多糖含量。結果重復性RSD值為1.01%。結果表明，本法重復性良好。

2.1.6精密度試驗

取一份供試品溶液，依法顯色后連續測定其吸光度A6次。結果精密度RSD值為0.650%。結果表明：本法精密度良好。

2.1.7穩定性試驗

取一份供試品溶液，依法顯色后分別在0.0、10、20、30、40、50 min測定其吸光度。結果穩定性RSD值為2.02%。結果表明，供試品溶液在1小時內吸光度值基本穩定。

2.1.8加樣回收率測定

取同一批次香菇6份，精密稱定，置50 mL量瓶中，分別加入1 mg/mL葡萄糖1 mL對照品適量，按供試品溶液的制備方法處理，測定，計算加樣回收率。結果平均回收率為97.10%，RSD值為0.722%。

2.1.9香菇多糖含量測定

按優選的供試品溶液制備方法，取香菇依法測定。進行3次平行實驗，分別計算多糖含量。結果見表4、圖6。

2.2蒽酮-硫酸法測定香菇中多糖含量［9］

2.2.1標準曲線的制備

葡萄糖對照品溶液的配制：取已干燥的無水葡萄糖20 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加水適量溶解，加水至刻度，搖勻，即得（每1 mL中含無水葡萄糖0.2 mg）。

標準曲線的繪制：精密量取對照品溶液0.0、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分別加水補至2 mL，置具塞試管中，分別加0.5%的蒽酮-濃硫酸溶液4 mL，搖勻，沸水中恒溫反應15 min，再于冰水中冷卻，終止其反應；以第一份為空白，照分光光度法（中國藥典附錄ⅤB），在615 nm處測定吸光度。以葡萄糖的濃度C為縱坐標，以吸光度A為橫坐標進行回歸處理，求得回歸方程y= 3.105 5x-0.041 1（濃度單位mg/2 mL），R2=0.997 7，結果見表3、圖4、圖5。

表3　線性關系考查結果Table 3　Results of linear correlation review

圖4　葡萄糖標準曲線紫外掃描色譜圖Fig.4　Rmylaceum standard curve UV chromatogram

圖5　葡萄糖標準曲線圖Fig.5　Amylaceum standard curve diagram

2.2.2供試品溶液的制備

取香菇粗粉約0.03 g，精密稱定，加水5 mL浸潤樣品，緩慢加入20 mL 95%乙醇，搖勻，超聲提取（1 000 Hz）30 min，濾過，用少量乙醇洗滌濾器，濾渣連同濾紙置燒瓶中，加水50 mL，加熱回流2 h，趁熱濾過，用少量熱水洗滌濾器，合并濾液與洗液，放冷，移至100 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。精密量取供試品溶液2.0 mL，照標準曲線的制備項下的方法，自“分別加0.5%的蒽酮-濃硫酸溶液4 mL”起，依法測定吸光度A，根據標準曲線計算出供試品溶液中多糖含量，計算，即得。

2.2.3檢測波長的確定

以空白為對照，對葡萄糖對照品溶液和供試品溶液在400 nm～800 nm波長范圍進行掃描測定。

結果表明葡萄糖對照品溶液和供試品溶液在615 nm左右有最大吸收，故確定615 nm為香菇多糖的測定波長。

2.2.4重復性試驗

按照供試品制備的方法同時制備6份供試品溶液，依法顯色后分別測定其吸光度A，計算香菇多糖含量。結果重復性RSD值為2.21%。本法重復性良好。

2.2.5精密度試驗

取一份供試品溶液，依法顯色后連續測定其吸光度A6次。結果精密度RSD值為1.26%。本法精密度良好。

2.2.6穩定性試驗

取一份供試品溶液，依法顯色后分別在0.0、10、20、30、40、60 min測定其吸光度。結果穩定性RSD值為2.61%。結果表明，供試品溶液在1 h內吸光度值基本穩定。

2.2.7加樣回收率試驗

加樣回收率測定：取同一批次香菇6份，精密稱定，置100mL量瓶中，分別加入1mL0.2mg/mL葡萄糖對照品，按供試品溶液的制備方法處理，測定，計算加樣回收率。結果平均回收率為96.8%，RSD值為2.19%。

2.2.8香菇多糖含量測定

按優選的供試品溶液制備方法，取香菇依法測定。進行3次平行實驗，分別計算多糖含量。結果見表4，圖6。

表4　香菇多糖含量測定結果Table 4　Results of Polycose of champignon content determine

圖6　香菇多糖含量測定紫外色譜圖Fig.6　UV diagram of Polycose of champignon content determine

3　討論

苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法都是測定多糖的常用方法。苯酚-硫酸法是糖在濃硫酸作用下，脫水生成的糠醛或羥甲基糠醛能與苯酚縮合成一種橙紅色化合物，其顏色深淺與糖的含量成正比，在485 nm波長左右有最大吸收峰，故而在此波長下測定。苯酚-硫酸法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的測定。蒽酮-硫酸法是糖在濃硫酸作用下，可經脫水反應生成糠醛或羥甲基糠醛，生成的糠醛或羥甲基糠醛可與蒽酮反應生成藍綠色糠醛衍生物，在一定范圍內，顏色的深淺與糖的含量成正比，故可用于糖的定量，蒽酮-硫酸法幾乎可以測定所有的碳水化合物，不但可以測定戊糖與己糖，而且可以測所有寡糖類和多糖類，其中包括淀粉、纖維素等，故應注意淀粉、纖維素的干擾；同時蒽酮-硫酸法不同的糖類與蒽酮試劑的顯色深度不同，果糖顯色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖較淺，五碳糖顯色更淺，故測定糖的混合物時，常因不同糖類的比例不同造成誤差，但測定單一糖類時，則可避免此種誤差。因為苯酚-硫酸法在一些方面的優勢，比蒽酮-硫酸法更為常用。

本試驗對同一批次的香菇采用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法進行了多糖含量的測定。測定結果二種方法重復性、精密度、穩定性均較好，回收率平均值均在95%～105%之間，測定多糖的含量結果雖然有顯著性差異（P＜0.01）（結果的差異性可能跟蒽酮-硫酸法不同的糖類與蒽酮試劑的顯色深度不同這一原因存在聯系），但結果數值很接近。因而兩種方法都能用于香菇中多糖的含量測定。中華人民共和國農業行業標準NY/T1676-2008《食用菌中粗多糖含量的測定》選用了苯酚-硫酸法作為香菇多糖的含量測定方法。

本試驗對香菇供試品溶液制備中提取方法進行了比較研究，即對常用的水提醇沉法和醇回流后水提取法進行了比較，試驗過程發現水提醇沉法更容易受干擾成分的的影響，導致結果偏高，因而宜選用醇回流后水提取法。

［1］王國強．全國中草藥匯編（卷二）［M］．北京:人民衛生出版社，2014: 285

［2］吳錦文．天然生理活性物質香菇多糖和靈芝多糖的國內外研究進展［J］．江蘇食用菌，1995，16（5）:33-34

［3］國家中醫藥管理局《中華本草》編委會．中華本草（第一部）［M］．上海:上海科學技術出版社，1998:571

［4］李翔，石代勇，李般程，等．香菇水提液多糖提取工藝及測定研究［J］．農產品加工，2013（6）:33-35

［5］王廣慧，戴明，王相剛．香菇多糖的提取條件研究［J］．食品研究與開發，2013，29（24）:71-73

［6］周玲，唐靜，李嬌，等．野生及人工培養香菇和黑木耳中粗多糖含量測定［J］．大理學院學報（綜合版），2008，7（8）:58-60

［7］石來寶，陳靜，殷霞．香菇多糖提取方法的研究［J］．藥學研究，2014，33（4）:200-202

［8］金貞姬，王菁．香菇多糖提取工藝的研究［J］．中國醫藥指南，2013，11（13）:71-72

［9］連錦明，黃穎，陳前火，等．蒽酮-硫酸法測定菌類保健品中的活性多糖［J］．吉林化工學院學報，2003（1）:13-15

Compare Study on Quantity Determine Method of Polycose of Lentinus edodes

ZHOU Yong1，YI Yan-kui2，*，YANG Xiao-min2，LI Ya-ping2
（1.Infinitus（China）Co.，Ltd.，Guangzhou 510665，Guangdong，China；2.Southern Medical University，Guangzhou 510515，Guangdong，China）

Taking phenol-sulphuric method and anthrone-sulphuric method determine quantity of polycose of champignon，to review the linear correlation，reproducibility，precision，stability and accuracy rating of the two method.There was no significant difference between the results of polycose of champignon by phenol-sulphuric method and anthrone-sulphuric method.Verification test results showed the linear correlation，reproducibility，precision，stability were all fairly well，the accuracy rating were all between 95%-105%.The experiment provided basis for the selection of quantity determine method of polycose of champignon.

Lentinus edodes；polycose；quantity determine；phenol-sulphuric method；anthrone-sulphuric method

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.030

廣州市白云區科技計劃項目（2012-KZ-85）

周勇（1980—），男（漢），工程師，碩士，主要從事保健食品研究開發。

易延逵，男，副教授，博士，主要研究方向：藥物新劑型、新技術的研究。

2015-07-10