透明質酸海洋膠原肽粉中β-胡蘿卜素的測定

王海東，姜水紅，查圣華，張宏（北京同仁堂健康藥業股份有限公司，北京100085）

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透明質酸海洋膠原肽粉中β-胡蘿卜素的測定

王海東，姜水紅，查圣華，張宏
（北京同仁堂健康藥業股份有限公司，北京100085）

建立透明質酸海洋膠原肽粉中β-胡蘿卜素的含量測定方法。樣品經淀粉酶處理后，用乙醇和三氯甲烷提取，離心，取上清液水浴蒸干，殘渣用乙醇溶解后轉移至氧化鋁柱進行層析純化。采用Waters XBridgeTMShield RP18色譜柱，以甲醇∶乙腈=90∶10（體積比）為流動相，PDA檢測器檢測。結果表明，在0～50 μg/mL范圍內β-胡蘿卜素呈線性關系（R2＞0.999），回收率為100.0%（RSD=2.3%，n=6）。該含量測定方法可用于以β-胡蘿卜素為原料的保健食品的檢測。

β-胡蘿卜素；HPLC；含量

類胡蘿卜素是四萜類化合物。在眾多類胡蘿卜成分之中，β-胡蘿卜素作為維生素A的前體，早已備受臨床醫藥界的關注。近年來隨著類胡蘿卜素的應用與研究在臨床醫學、臨床藥理、食品工業、及化妝品工業的迅猛發展，特別是90年代以來，有關專家對其作用機制在流行病學、保健預防疾病的作用方面進行了廣泛和深入的研究探討，并取得了相當的成果［1］。β-胡蘿卜素不僅是人體內維生素A的重要來源，而且其本身對人體也具有很重要的生理功能，它可以預防、延緩和治療某些疾病，尤其是癌癥，同時也能提高機體的免疫功能［2］。β-胡蘿卜素還作為食品添加劑和營養增補劑，被聯合國糧農組織（FAO）和世界衛生組織（WHO）食品添加劑聯合專家委員會推薦，被認為A類優秀和有營養的食品添加劑［3］。近年來國內對其關注越來越高，其研究和探討也十分活躍。

目前一些添加了β-胡蘿卜素成分的保健食品為了保證該成分的穩定性，對其進行了包埋處理，當采用國標法GB/T 5009.83-2003《食品中胡蘿卜素的測定》第一法進行測定時，結果比添加量明顯偏低，針對這一現象，該文在國標法基礎上，增加了樣品去包埋前處理過程，并對修改后的方法進行了全面的方法學驗證。

1　材料與方法

1.1儀器

2695-2998高效液相色譜儀：美國Waters公司；CPA225D電子天平：德國Sartorius公司；3-15離心機：德國Sigma公司；KQ3200DE數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；DZKW-D-4電熱恒溫水浴鍋：北京永光明醫療儀器廠。

1.2試劑

β-胡蘿卜素標準品（中國食品藥品檢定研究院，30.9%），甲醇和乙腈（色譜純，J.T.Baker），水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.3樣品

透明質酸海洋膠原肽粉由北京同仁堂健康藥業股份有限公司提供。

2　方法

2.1色譜條件

色譜柱：Waters XBridgeTMShield RP18（4.6 mm× 150 mm，5 μm）；流動相∶甲醇∶乙腈=90∶10（體積比）；流速：1.2 mL/min；檢測波長：448 nm；柱溫：30℃。

2.2標準液

精確稱取β-胡蘿卜素32.36 mg于燒杯中，先用少量三氯甲烷溶解，再用石油醚溶解并洗滌燒杯數次，溶液轉入100 mL棕色容量瓶中，用石油醚定容，濃度為100 μg/mL。

2.3試樣制備（以下操作需避光進行）

2.3.1試樣提取

取樣品約1 g，精密稱定，置于250 mL容量瓶中，再加入0.2 g淀粉酶，加10 mL 60℃的蒸餾水，并在60℃水浴中超聲5min，加入100mL無水乙醇和100mL三氯甲烷，再次水浴超聲處理5 min，冷卻后加三氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，取出部分內容物置于具塞離心管內離心5 min（轉速約4 000 r/min），吸取上清液5 mL于蒸發皿中，置于40℃水浴上揮干，然后加1 mL（95%）乙醇溶解殘渣。

2.3.2純化

將2.3.1的試樣提取液殘渣溶解液，用少量石油醚溶解，然后進行氧化鋁層析。氧化鋁柱為1.5 cm（內徑）× 4 cm（高）。先用洗脫液丙酮+石油醚（丙酮與石油醚體積比為5∶95）洗氧化鋁柱，然后再加入溶解試樣提取液的溶液，用丙酮+石油醚（5+95）洗脫β-胡蘿卜素，控制流速為20滴/min，收集于10 mL容量瓶中，用洗脫液定容至刻度。用0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液做HPLC分析用［4］。

2.4線性關系考察

分別吸取標準溶液各0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL容量瓶中，各加移動相至刻度，搖勻后，分別取20 μL注入液相色譜儀，測定，以β-胡蘿卜素含量為橫坐標，以β-胡蘿卜素峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

2.5精密度實驗

取同一試樣溶液重復進樣6次，以β-胡蘿卜素峰面積計，計算6次峰面積的RSD。

2.6穩定性實驗

取1份樣品溶液，在4℃避光密封儲存條件下，分別于0、6、12、24、36、48、72 h時取出，緩溫至室溫，測定。

2.7重復性實驗

取樣品6份，制備試樣溶液，分別取20 μL注入液相色譜儀，計算β-胡蘿卜素的含量。

2.8加標回收率實驗

取已知含量樣品6份，分別置250 mL量瓶中，加10 mL 60℃的蒸餾水，再加入0.2 g淀粉酶，并在60℃水浴中超聲5 min，加入100 mL無水乙醇和100 mL三氯甲烷，然后加入對照品溶液（1 952 μg/mL）1.0 mL，按2.3方法繼續制備供試品溶液，進樣20 μL，測定含量。

2.9檢出限與定量限

配制一系列濃度的標準溶液，取20 μL注入液相色譜儀，以β-胡蘿卜素峰計算信噪比。

3　結果

3.1線性關系

標準曲線回歸方程為Y＝207 427x-13 758，R2= 0.999 6，線性范圍：0～50 μg/mL，線性良好，見圖1。

圖1　標準品重疊譜圖Fig.1　Overlapping spectra of the standard

3.2精密度實驗

6次峰面積的RSD=0.2%，進樣精密度良好，見圖2。

圖2　進樣精密度重疊譜圖Fig.2　Overlapping spectra of the sampling precision

3.3穩定性實驗

試驗結果以β-胡蘿卜素峰面積計，RSD=0.63%，說明樣液在72 h內穩定，見圖3。

圖3　試樣溶液穩定性重疊譜圖Fig.3　Overlapping spectra of sample solution stability

3.4重復性試驗

6份樣品結果的RSD=1.2%，試驗重現性良好，見表1。

表1　重復性試驗結果Table 1　The results of the repetitive experiment

3.5加標回收率

β-胡蘿卜素的平均回收率為100.0%，RSD=2.3%。見表2。

表2　回收率試驗結果Table 2　The results of the recovery experiment

3.6檢出限與定量限

標準溶液濃度為0.01 μg/mL時，信噪比為4.6＞3，可設為檢出限；濃度為0.03 μg/mL時，信噪比為14.4＞10，可設為定量限，并對其重復進樣6次，以β-胡蘿卜素峰面積計，RSD為2.5%，精密度良好，見表3和表4。

表3　標準溶液信噪比Table 3　The signal-to-noise ratio of the standard solution

表4　定量限重復性Table 4　The repetitive experiment ofthe loq

4　結論

β-胡蘿卜素在448 nm處吸收峰峰形對稱良好，無過多干擾峰；此方法樣品分析時間短，重現性、穩定性及準確度良好，在0～50 μg/mL范圍內線性關系良好，可為保健食品及原料中β-胡蘿卜素的含量測定提供參考。

5　討論

樣品中β-胡蘿卜素因為加包埋處理，直接用國標法GB/T 5009.83-2003《食品中胡蘿卜素的測定》中第一法檢測，結果比實際添加量偏低很多，所以添加淀粉酶去包埋處理樣品，使結果更加準確。同時試驗要注意在避光下操作，標準品應低溫避光保存，而且最好以新購未開封標準品為宜，否則將對試驗結果產生較大影響。

［1］王慶偉.類胡蘿卜素的研究進展與臨床應用［J］.中國藥事，2000，14（1）:58-60

［2］朱秀靈，車振明，徐偉，等.β-胡蘿卜素的生理功能及其提取技術的研究進展［J］.廣州食品工業科技2004，20（2）:158-162

［3］唐劉蘊泉，蔡皓.β-胡蘿卜素應用的研究進展［J］.腸外與腸內營養，2005，12（2）:121-123

［4］中華人民共和國衛生部，中國國家標準化管理委員會.GB/T 5009.83-2003《食品中胡蘿卜素的測定》［S］.北京:中國標準出版社，2003:3-4

Determining the Content of Carotenoids in Hyaluronic Acid Marine Collagen Peptide Powder

WANG Hai-dong，JIANG Shui-hong，ZHA Sheng-hua，ZHANG Hong

（Beijing TongRenTang Health-Pharmaceutical Co.，Ltd.，Beijing 100085，China）

A practical method for determining the content of carotenoids in hyaluronic acid marine collagen peptide powder was established.After the samples were processed by amylase，extracted with ethanol and chloroform，centrifugal，and the extract was to dry in a water bath，then the residue after dissolved with ethanol and transferred to the alumina column chromatography purification.Using the chromatographic column of Waters XBridgeTMShield RP18；mobilephase，methanol∶acetonitrile=90∶10（volume ratio）；tested with the PDAdetector.Result showed that the linear relationship was good in the range of 0-50 μg/mL for carotenoids，（R2＞0.999）.The recovery of carotenoids was 100.0%（RSD=2.3%，n=6）.This method can be used for detecting health care food with beta carotene as raw materials.

β-carotene；HPLC；content

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.023

國家863計劃項目（2014AA022109）

王海東（1987—），男（漢），助理工程師，學士，研究方向：食品藥品質量研究。

2015-07-09