橙皮多糖組成、理化性質及抗氧化性檢測*

喬立龍，程翠利，周春姣，王輝憲，蔣紅梅

(湖南農業大學理學院，湖南　長沙　410128)

?

橙皮多糖組成、理化性質及抗氧化性檢測*

喬立龍，程翠利，周春姣，王輝憲，蔣紅梅

(湖南農業大學理學院，湖南長沙410128)

探索并優化了橙皮多糖的提取工藝條件，檢測純化后橙皮多糖的組成，理化性質及抗氧化性；方法：采用用單因素及正交實驗設計探索并優化超聲波輔助提取橙皮多糖的工藝條件，粗多糖經氯仿:正丁醇(5:1，V:V)去蛋白、濃縮、乙醇沉淀后冷凍干燥，利用離子色譜技術分析純化后橙皮多糖的組成，采用常規理化檢測方法及體外抗氧化實驗檢測了純化后橙皮多糖的理化性質及抗氧化性能力。結果表明離子色譜法測得橙皮多糖由3種單糖組成，分別為鼠李糖、葡萄糖、半乳糖醛酸；理化性質實驗結果顯示，橙皮多糖溶于水，微溶于體積分數為95%乙醇，不溶于乙醚、丙酮，灰分含量為0.1191%，蛋白質含量為0.15 mg/g抗氧化能力低于抗壞血酸(Vc)和2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)，橙皮粗多糖抗氧化能力優于精制橙皮多糖。

多糖；橙皮；組成；理化性質；抗氧化能力

陳皮，為蕓香科植物橘CitrusreticulataBlanco及其栽培變種的干燥成熟果皮，是傳統中藥材。具有理氣健脾，調中，燥濕，化痰等功效。在《本草綱目》、《日用本草》中均有記載。橙皮中富含豐富的色素、苷類、果膠、纖維、香精油、礦物質、多糖。目前, 國內外對柑、橘、橙、柚等同類果實果皮的利用主要體現在藥品、食品及化妝品的香精油、色素、果膠、苷類的提取[1-5]。

多糖即多聚糖(Polysaccharide)一般是指由十個或十個以上的單糖通過糖苷鍵聚合而成的一種生物大分子，其分子量可以從幾千到數百萬[6-9]。多糖不僅是生物體的重要營養物質，而且在生命活動中發揮著關鍵作用[10]，廣泛分布于生物界特別是植物界[11-12]。近幾十年的研究發現,從植物中提取的多糖擁有免疫調節、抗腫瘤以及降血脂、抗氧化、抗病毒等生物活性[13-17]。利用植物多糖的生物活性，將具有廣闊的應用前景。本實驗以水作為提取劑提取橙皮多糖，分析了橙皮多糖的組成，理化性質及抗氧化性研究。為橙皮多糖的開發與利用提供基礎數據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

臍橙(Citrus sinensis Osbeck)，湖南永州。

葡萄糖標準品(純度≥98%)，中國食品藥品檢定研究院；抗壞血酸(AR)，中國醫藥上海化學試劑公司；2,6-二叔丁基對甲酚(AR)，上海凌峰化學試劑有限公司；三吡啶基三嗪(AR)，東京化成工業株式會社；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(AR)，東京化成工業株式會社；其它試劑為國產分析純。

RE-2000B旋轉蒸發儀，鞏義市予華儀器；真空冷凍干燥機，北京博醫康實驗儀器；SHIMADZU UV-2450型紫外可見分光光度計，日本島津； SB25-12DT超聲波清洗機，寧波新芝生物科技；DIONEX ICS-900離子色譜儀，美國戴安；DIONEX PAD-2 脈沖安培檢測器，美國戴安；METROSEP CARB(150 mm×4.0 mm)陰離子交換柱，瑞士萬通。

1.2方法

1.2.1葡萄糖標準曲線制作

精密稱取于105 ℃干燥至恒重的葡萄糖標準品100 mg，定容至100 mL容量瓶中，得質量濃度為1 mg/mL的葡萄糖標準液。精密吸取0.1 g/L標準葡萄糖溶液0.0 mL, 0.2 mL, 0.4 mL, 0.6 mL, 0.8 mL, 1.0 mL，1.2 mL于10 mL具塞試管中，補加蒸餾水至2 mL，分別加入5%苯酚溶液1 mL，混合均勻后快速加入濃硫酸5.0 mL，即刻搖勻，室溫靜置20 min，在波長200～800 nm之間掃描，確定最佳吸收波長為490 nm，在此波長處測定吸光度，得回歸方程：A=0.0438C+0.0054，相關系數R2=0.9997。A為吸光度，C為葡萄糖濃度。

1.2.2橙皮多糖的提取和含量測定流程

新鮮臍橙皮→干燥→粉碎→干粉→蒸餾水→超聲→定容→離心→取上層清液(濃縮可得橙皮粗多糖)→同標準曲線制作步驟測定吸光度→根據回歸方程計算含量

提取液中多糖質量(以葡萄糖當量計算)=c×V×稀釋倍數

式中：c——標準曲線上查得的葡萄糖濃度，mg/mL

V——橙皮多糖提取液體積，mL

1.2.3橙皮多糖提取條件優化

稱取1 g橙皮粉末，通過超聲波輔助法進行橙皮多糖的提取，固定液固比45:1，超聲溫度60 ℃，超聲時間30 min，提取一次。分別考察液固比、超聲溫度、超聲時間對橙皮多糖提取率的影響。根據單因素試驗結果，設計L9(33)正交試驗表，進行正交試驗，優化橙皮多糖的提取工藝。

1.2.4橙皮多糖的純化

橙皮多糖提取液→Sevage法[18]除蛋白→旋轉蒸發濃縮→乙醇沉淀24 h→離心→沉淀→丙酮、乙醚洗滌抽濾→真空冷凍干燥→精制橙皮多糖

1.2.5離子色譜法測定橙皮多糖的單糖組成

準確稱取精制橙皮多糖51.0 mg于100 mL容量瓶中，用1 mol/L醋酸水溶液定容至100 mL，超聲6 h。多糖水解液經C18柱過濾，濾液轉入樣品管中，進行離子色譜單糖檢測分析。

檢測條件：儀器型號：ICS-900；檢測器：脈沖安培檢測器；METROSEP CARB(150 mm×4.0 mm)陰離子交換柱；進樣體積10.0 mL；淋洗液：6.0 mmol/L NaOH；流速：1.0 mL/min，柱溫：32 ℃；再生液：200 mmol/L NaOH；分析時間為60 min。

1.2.6橙皮多糖理化性質的研究

橙皮多糖溶解性及其水溶液pH值實驗：提取的粗多糖經純化后，觀察其顏色、狀態、氣味；取等量純化后多糖分別溶于水、乙醇、乙醚、丙酮，觀察溶解情況。取一定量純化后橙皮多糖水溶液測定pH值。

灰分含量的測定：用灼燒至恒重的坩堝稱取經P2O5干燥至恒重的純化后橙皮多糖樣品50～100 mg(精確至0.0002 g)，置馬弗爐于740 ℃下灼燒12 h，燒至恒重為止，冷卻至室溫，稱重。

水溶液特性黏數測定：根據《黏度測定法 中國藥品檢驗標準操作規范2010版》中第三種方法測定特性黏數。

蛋白質含量測定：參照文獻[19]的方法，測定純化后橙皮多糖中蛋白質的含量。

糖醛酸檢測：糖醛酸與咔唑反應生成紫紅色化合物，用硫酸-咔唑反應可以鑒別有無糖醛酸。試劑配制：稱取咔唑0.125 g 溶于100 mL體積分數95%乙醇中，置于棕色試劑瓶中4 ℃保存。測量步驟如下：將質量濃度為12 mg/mL的純化后橙皮多糖水溶液2.0 mL緩慢加入盛有12.0 mL濃硫酸的大試管中，然后在沸水浴中加熱10 min，冷卻至室溫，加入上述咔唑乙醇溶液0.4 mL，充分混勻，室溫下放置30 min，觀察有無紫紅色化合物生成。

淀粉檢測：利用稀釋的碘-碘化鉀溶液與淀粉作用時，形成碘化淀粉，呈藍色的特殊反應，可以用來鑒定有無淀粉。所需試劑為碘化鉀3 g，蒸餾水100 mL，碘1 g。先將碘化鉀溶于蒸餾水中，待全部溶解后再加碘，振蕩溶解。取1.0 mg/mL的橙皮多糖溶液1.0 mL，加入碘-碘化鉀試劑2滴，觀察顏色變化。以蒸餾水為陰性對照，1.0 mg/mL 淀粉溶液為陽性對照。

1.2.7橙皮多糖抗氧化能力測定

2　結果與分析

2.1超聲波輔助法提取橙皮中多糖的提取工藝優化

圖1　固液化、超聲時間和超聲溫度對萃取劑產量的影響

考察不同料液比、超聲時間、超聲溫度等因素對橙皮多糖得率的影響見圖1。可以看出，超聲溫度為60 ℃時，橙皮粗多糖得率達到最大值，隨后隨溫度的升高提取率反而下降，這可能是因為過高的溫度導致了部分多糖的分解或與其它雜質發生了反應。料液比對橙皮多糖得率有明顯的影響，當料液比達到 1:45時，橙皮多糖得率達到最大值。超聲時間比對橙皮粗多糖得率的影響較小，當時間從 10 min增加到20 min時，多糖得率升高，之后隨著時間的增加，多糖得率趨于平穩。

根據單因素試驗結果，設計L9(33)正交試驗表，進行正交試驗，結果見表1。正交實驗的極差分析結果表明：橙皮多糖提取率的影響因素為料液比>超聲溫度>超聲時間。料液比為1:15，時間為20 min，溫度為70 ℃為最佳提取工藝，此時橙皮多糖的得率為6.32%。為了驗證實驗的可靠性，設計最佳工藝的平行實驗，平行實驗結果證明實驗的重復性可靠。

表1　正交試驗

2.2離子色譜法檢測橙皮多糖的單糖組成

按1.3.5方法對純化后橙皮多糖進行處理，用離子色譜法檢測橙皮多糖分子中的單糖組成。檢測結果見圖2。 由圖2可以看出，橙皮多糖主要由三種單糖組成，即鼠李糖、葡萄糖、半乳糖醛酸，半乳糖醛酸含量53.909 mg/g最多，只含少量的鼠李糖、葡萄糖。

表2　橙皮多糖的離子色譜

2.3橙皮多糖理化性質檢測結果

按1.3.6方法對純化后橙皮多糖的理化性質進行了檢測，檢測結果顯示：橙皮多糖溶于水，微溶于95%乙醇，不溶于乙醚、丙酮；其溶液的pH值為5.83；灰分含量為0.1191%；蛋白質含量為0.15 mg/g；硫酸-咔唑反應有紫紅色化合物生成，說明精制橙皮多糖里面含有較多的糖醛酸；碘-碘化鉀反應顏色深于陰性對照淺于陽性對照，說明其淀粉含量很低。

2.4橙皮多糖抗氧化能力測定結果

圖3　樣品的抗氧化能力

3　討　論

離子色譜法結果表明：橙皮多糖主要由鼠李糖、葡萄糖、半乳糖醛酸三種單糖組成。橙皮多糖的硫酸-咔唑反應有紫紅色化合物生成，進一步證實橙皮多糖里面含有較多的半乳糖醛酸；已有研究表明，半乳糖醛酸對癌細胞增殖具有一定的抑制作用，如糖聚合度為5的β-(1→4)-半乳寡糖醛酸(AOG)具有顯著預防實驗性結腸炎癌變(93.5%)的功能[23]，半乳糖醛酸增加改性后的甘薯果膠對結腸癌細胞HT-29、乳腺癌細胞Bcap-37增殖具有明顯的抑制作用[24]。橙皮多糖是否同樣具有抗癌細胞增殖能力還有待進一步證實，此外，橙皮多糖中單糖之間的連接方式、連接位置、分子量等信息仍不完整，還有待進一步深入細致的研究。

[1]單楊. 我國柑橘工業現狀及發展趨勢[J]. 農業工程技術(農產品加工業), 2014(4):13-17.

[2]曾超珍,劉志祥,曾柏全.微波技術提取柑橘皮中的橙皮甙[J].食品科技, 2007,32(10):224-226.

[3]耿敬章,白雪.超聲波輔助提取橘皮色素的工藝優化[J].中國食品添加劑, 2010(6):67-71.

[4]韋鑫,班淼,黃鎖義,等.從橙子皮中提取果膠的工藝研究[J].精細化工中間體, 2005,35(3):55-56.

[5]王兆梅,李琳,郭祀遠,魏東.生物活性多糖在化妝品中的應用[J].日用化學工業,2004,34(4):245-248.

[6]謝紅旗.香菇多糖提取、純化、結構表征及生物活性的研究[D]. 長沙:中南大學,2007.

[7]TONG Haibin, LIU Ximing, TIAN Dan, et al. Purification, chemical characterization and radical scavenging activities of alkali-extracted polysaccharide fractions isolated from the fruit bodies of Tricholoma matsutak[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2013, 29(5): 775-780.

[8]HE Peixin, GENG Lujing, WANG Jizhong, et al. Purification, characterization and bioactivity of an extracellular polysaccharide produced from Phellinus igniarius.[J]. Annals of Microbiology, 2012, 62(4):1697-1707.

[9]ZHOU Huabin, LIU Gaoqiang, HUANG Furu, et al. Improved production, purification and bioactivity of a polysaccharide from submerged cultured Ganoderma lucidum[J]. Archives of Pharmacal Research. DOI:10.1007/s12272-014-0391-8.

[10]RAVI G., VENKATESH Y P. Recognition of riboflavin and the capsular polysaccharide of Haemophilus influenzae type b by antibodies generated to the haptenic epitope D-ribitol[J]. Glycoconjugate Journal.， 2014, 31(3):247-258.

[11]AZIKE C G, CHARPENTIER P A, LUI E M. Stimulation and Suppression of Innate Immune Function by American Ginseng Polysaccharides: Biological Relevance and Identification of Bioactives[J]. Pharmaceutical Research.,DOI:10.1007/s11095-014-1503-3.

[12]毛宇奇,張建鵬.植物多糖抗衰老作用的研究進展[J].生物技術通訊,2014,25(4):588-590.

[13]KIM T H, KIM J S, KIM Z H, et al. Khz-cp (crude polysaccharide extract obtained from the fusion of Ganoderma lucidum and Polyporus umbellatus mycelia) induces apoptosis by increasing intracellular calcium levels and activating P38 and NADPH oxidase-dependent generation of reactive oxygen species in SNU-1 cells[J]. BMC Complementary and Alternative Medicine, DOI:10.1186/1472-6882-14-236.

[14]CHO Y J, SON H J, KIM K S. A 14-week randomized, placebo-controlled, double-blind clinical trial to evaluate the efficacy and safety of ginseng polysaccharide (Y-75) [J]. Journal of Translational Medicine, DOI:10.1186/s12967-014-0283-1.

[15]HUANG Xiongqing,TANG Juan,ZHOU Qin, et al. Polysaccharide from Fuzi (FPS) Prevents Hypercholesterolemia in Rats[J].Lipids in Health and Disease, DOI:10.1186/1476-511X-9-9.

[16]Lee Koetzner, Gary Grover, Jamie Boulet,,et al. Plant-Derived Polysaccharide Supplements Inhibit Dextran Sulfate Sodium-Induced Colitis in the Rat[J]. Digestive Diseases and Sciences, 2010, 55(5): 1278-1285.

[17]Fhernanda R Smiderle, Andrea C Ruthes, Jeroen van Arkel1 et al.Polysaccharides from Agaricus bisporus and Agaricus brasiliensis show similarities in their structures and their immunomodulatory effects on human monocytic THP-1 cells[J].BMC Complementary and Alternative Medicine, Doi:10.1186/1472-6882-11-58.

[18]穆文靜,杜玲,扈瑞平,等.鈍頂螺旋藻多糖Sevage法脫蛋白工藝的研究[J].內蒙古石油化工,2010(10):1-4.

[19]趙二勞,張海容,李滿秀.葡萄酒對亞硝酸鹽和DPPH自由基清除能力的研究[J].釀酒科技,2006(10):27-28.

[20]Benzie IFF, Strain JJ. The ferric reducing ability of plasma as a measure of ‘antioxidant power’: the FRAP assay[J].Analytical Biochemistry,1996,239:70-76.

[21]玄紅專,桑青,麻建軍. 鄰苯三酚自氧化法測定不同蜂產品抗氧化活性的研究[J].食品科技 2008,33(4):137-139.

[22]王孝平,邢樹禮.考馬斯亮藍法測定蛋白含量的研究[J].天津化工,2009,23(3):40-41.

[23]秦文星. AOG抑制LPS誘導的TLR-4/MD-2/NF-κB信號通路活化的機制研究[D].上海:第二軍醫大學博士學位論文,2013.

[24]張燕燕,木泰華,張苗. 改性甘薯果膠對癌細胞增殖的影響[J].中國農業科學,2012,45(9):1798-1806.

Determination of the Monosaccharide Components, Physicochemical Property and Antioxidant Activity of Polysaccharides from Orange Peel*

QIAO Li-long, CHENG Cui-li, ZHOU Chun-jiao, WANG Hui-xian, JIANG Hong-mei

(College of science, Hunan Agricultural University, Hunan Changsha 410128, China)

polysaccharides; orange peel; composition; physicochemical property; antioxidant capacity

湖南省科技計劃項目(2014WK3011);湖南省教育廳項目(10C0816)；湖南農業大學科學基金項目(109WD16)；大學生科技創新基金項目(DFCXY201219)；湖南中煙工業有限責任公司合作項目。

O629.12

A

1001-9677(2016)01-0125-04